可能需要多种技术来描述不同批次肝素的关键参数。通过多角度静态光散射(MALS)测量的重量平均摩尔质量和动态光散射(DLS)测量的流体力学半径可以表征分子的大小和多分散性。可以使用这些数量作为批与批比较的度量标准，并对来自不同供应商的肝素进行鉴定。大量平行相位分析光散射(MP-PALS)和DLS用于计算净电荷和表征样品的纯度。这项研究比较了来自两个供应商的肝素，包括一批用过硫酸盐材料改性的肝素。
结果与讨论
尺寸排斥色谱结合MALS测定重量-平均摩尔质量(Mw）对于不同的肝素样品和肝素质量标准。m的差异w流体力学半径(rh)之间的差距小于10%。M相差很小w和R.h(<5%)未修饰的肝素和来自同一供应商的肝素用过硫酸盐材料修饰。因此，仅大小不能用于鉴定受污染肝素样本。
使用Wyatt Möbius，同时测量z-平均电泳迁移率和rh，以获得肝素分子的净电荷。对这些未分离样品测定的电荷与肝素摩尔质量标准板测定的电荷进行了比较。结果表明，有效分子电荷与分子量呈线性关系，电荷质量比恒定。
通过两个供应商未改性肝素遵循相同的线性关系，但超硫酸化材料表现出负电荷增加30％。每单位质量的负电荷的增加与改性肝素样品中的硫酸盐基团的增加一致。
因此，Mw通过SEC-MALS和MP-PALS的净电荷提供了未改性和污染肝素的明确区分。这种多技术方法确定电荷:质量比，使快速，非破坏性的表征不同批次的肝素。图1显示了肝素的分子结构。
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图1所示。肝素(左)和硫酸软骨素(右)分子结构。硫酸根有望增加被硫酸软骨素污染的肝素样品的负电荷。
百特国际公司提供了未分离的肝素样品和分离的肝素标准品(肝素衍生多糖，Neoparin, Inc.)。样品溶解在0.1M乙酸铵中，最终浓度约为5mg/mL，并在室温下平衡过夜，然后开始分析。
MP-PALS分析使用Wyatt Möbius;当样品直接注射到Möbius时，使用注射器尖端过滤器(Anotop, Whatman)过滤到0.02µm;流动单元。采用动态光散射法(DLS)同时测量了大平行相位分析光散射法(MP-PALS)的电泳迁移率和流体力学半径。
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重量平均摩尔质量(Mw）使用多角度静态光散射（MAL）测定每个样品。通过与MALS偶联的尺寸排阻色谱（SEC）测量分级肝素样品的摩尔质量和多分散性。将未滤器的样品注入色谱柱上，使用Dawn Heleosmals检测器和Optilab Rex折射率检测器测量洗脱样品的摩尔质量。Baxter International，Inc。提供了联合肝素的SEC-MALS数据
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图2。覆盖来自两个不同供应商的肝素SEC-MALS数据，包括一个被“过硫酸盐”物质污染的样本。
如表1所示，纯肝素和肝素与供应商2的超硫酸盐污染的摩尔质量（5％）的差异小于来自来自两种不同供应商的纯肝素的摩尔质量的摩尔质量差异（18％））。此外，纯肝素的流体动力半径与用超硫酸化材料污染的样品难以区分。
表1．未分离肝素样品的重量-平均摩尔质量和z-平均流体力学半径。
|
米w(kDa) |
rh(nm) |
| 未分离肝素，供方 |
15.9±0.1 |
2.30±0.02 |
| 未分离肝素，供方2 |
18.8±0.3 |
2.48±0.01 |
| 超级硫酸化肝素，供应商2 |
17.9±0.0 |
2.49±0.02 |
图3显示了用于测量电泳迁移率的典型“V图”。负电泳迁移率（μ）表示肝素样品具有负净电荷。然后根据电泳迁移率和流体动力电荷和重均线半径来计算有效的分子电荷和ζ电位。这些参数总结了表2中的未分支肝素样品和分级样品（NHP）。
表2．用MP-PALS测定电泳迁移率、净电荷和ζ电位。
|
流动性((µm *厘米)/ (s * V)) |
有效充电（Z *） |
Zeta潜力（MV） |
rH(nm) |
| 未分离肝素，供方 |
-1.00±0.05 |
-7.1±0.40 |
-16.9±0.9 |
2.30±0.02 |
| 未分离肝素，供方2 |
-1.18±0.09 |
-9.3±0.64 |
-19.5±1.5 |
2.48±0.01 |
| 超级硫酸化肝素，供应商2 |
-1.46±0.12 |
-11.2±0.96 |
-23.8±1.9 |
2.49±0.02 |
| 额定马力三世 |
-0.42±0.03 |
-3.2±0.26 |
-7.9±0.57 |
2.19±0.02 |
| 额定马力四世 |
-0.65±0.10 |
-4.2±0.56 |
-11.8±1.7 |
2.09±0.02 |
| 额定马力六世 |
-0.86±0.05 |
-7.1±0.39 |
-15.8±0.9 |
2.43±0.02 |
| NHP VII. |
-0.85±0.10 |
-14.2±1.8 |
-14.2±1.7 |
3.74±0.03 |
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图3。肝素标准品的净电荷与摩尔质量呈线性关系，表明电荷质量比恒定。两家供应商的纯肝素样品均服从相同的线性关系，但肝素被过硫酸盐污染。
在三种无机化样品中，超硫酸化材料表现出最大的净电荷。然而，超硫酸化和纯样品之间的电荷差异与两个供应商的电荷差相同。差异可能只反映摩尔质量或多分散性的差异。
分级肝素标准（NHP III，IV，VI和VII）的净摩尔质量用于产生纯肝素的校准曲线。这四个样品建立了纯肝素的净电荷和摩尔质量之间的线性关系，表明恒定电荷：质量比。基于他们测量的mw，供应商1和供应商2对未分离肝素的净收费低于预期价值的2%。然而，供方2的过硫酸盐肝素的测量净电荷比该规格肝素的预期净电荷高约30%。
结论
电泳迁移率和流体力学半径的同时测量使有效分子电荷的快速、非破坏性表征成为可能。通过电泳迁移率的变化测量负电荷的增加，与修饰后肝素样品中硫酸盐基团的增加是一致的。
与被过硫酸盐污染的肝素样品相比，电荷的增加与样品的摩尔质量的结合为纯肝素样品提供了一个独特的指纹。在这项研究中，有效电荷:质量比清楚地区分了未改性和过硫酸盐肝素，并可作为一个标准来鉴定不同的样品。
参考
经许可转载《按电荷质量比鉴别肝素和硫酸软骨素》Wyatt Technology的白皮书。
这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩
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