分析高性能液相色谱法正被广泛地用作鉴别和定量样品中存在的分子物种的方法。高效液相色谱系统包括一系列在线检测器，包括紫外/可见吸收、荧光、蒸发光散射(ELS)和质谱(MS)。
差示折射率检测(dRI)也很常见，适用于从小分子到蛋白质、石油、多糖和合成聚合物的各种HPLC应用。
超高效液相色谱(UHPLC)在应用和概念上与高效液相色谱相似，但使用更小的色谱柱，紧密地填充更小的珠。本文介绍了几种基于在线RI UHPLC检测器的基本UHPLC分析。从这些例子中可以看出，在线UHPLC dRI检测器不会影响UHPLC的分辨率。
涵盖的应用包括柱校准，根据UV:dRI的比例来区分洗脱物质，对不同注入质量的响应线性，检测非UV活性杂质，以及在溶剂梯度背景下检测样品峰。欧洲杯足球竞彩
蛋白质片段或杂质
牛血清白蛋白(BSA)是一种常用的蛋白质定量和浓度测定试剂。虽然BSA的单体含量高达97-98%，但溶液中仍有少量蛋白质物质不是BSA单体。大多数附加蛋白是牛血清白蛋白的不可逆聚集物(即二聚体和微调体)。这些不依赖于浓度的低聚物通过高效液相色谱粒度排除色谱结合多角度光散射(SEC-MALS)进行了清晰的分析和检测。
通过UHPLC的高分辨率分离，在牛血清白蛋白中出现了一个新的特征，小峰洗脱时间晚于主单体，如图1所示。
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图1所示。用300mm尺寸的排样柱和UV + UT-rEX RI UHPLC在牛血清白蛋白中检测到少量杂质或片段。不同的UV:RI比的片段相对于单体和二聚体表明不同的初级组成。
dRI色谱迹显示了一个新峰。此峰有三种来源:错误折叠的牛血清白蛋白单体、牛血清白蛋白的片段或外来分子。整个BSA分子的任何变体，如聚集体或未折叠的蛋白质，都具有相同的组成比例，因此具有一个常数紫外线:RI比；(例如，BSA二聚体表现出与单体相同的比例)。的紫外线:RI比新峰的含量比单体高60-70%，说明新物种相对于单体在紫外活性物质中富集，不可能是聚集体或错误折叠的BSA。它必须是外来的或者是片段。
同分异构体
阻垢柱与大分子之间的相互作用本质上主要是水动力作用。因此，任何给定物种的洗脱时间是由分子的形状和大小决定的。具有相同摩尔质量但不同构象的蛋白质与柱珠的相互作用略有不同，洗脱时间略有不同。标准高效液相色谱法尺寸排除色谱法，或使用短柱(150mm)的UHPLC SEC，通常不能分解异构体，除非它们有很大不同的形状(例如，一个是变性的)。
通用检测和柱校准
大多数检测技术有溶剂依赖或特定的样品限制。紫外或荧光分析要求样品含有合适的紫外活性发色团，蒸发光散射需要挥发性溶剂。与dRI兼容的部分样品列表是:蛋白质，碳水化合物，寡核苷酸，脂类，小分子药物化合物和油。图2显示了在线UHPLC dRI检测器如何与反相UHPLC色谱柱一起用于糖的分离。
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图2。糖分离采用特殊的UHPLC色谱柱，UT-rEX检测。
UV-Inactive杂质检测
紫外线活性物质(如蛋白质)的质量控制通常包括结合紫外线检测器的分析UHPLC-SEC。然而，样品中存在的杂质可能并不总是含有发色团，因此会通过而不被检测到。在这种情况下，掺假的样品将滑过QC测试而不提高任何警告标志。
样品的溶剂梯度检测
通常溶剂梯度伴随着流动相折射率的相当大的变化，压倒和饱和大多数在线差示折射率探测器。虽然在基于梯度的分离中通常首选使用不同的检测技术，但有时RI可能是唯一可用的选项。图3显示了反相乙腈/水梯度的分析。
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图3。反相乙腈/水梯度，10%→90%，dRI分析。样品是溶菌酶。上图:250µg溶菌酶注射后的原始数据，在剧烈变化的RI信号上显示为一个小特征。下:基线减去后，这一次从25µg溶菌酶注射(在梯度基线上几乎看不见)。早期洗脱，小峰未鉴定。
结论
折射率检测为UPHLC提供了许多重要的优点。作为通用检测器，一种在线UHPLC dRI检测器(如Optilab®UT-rEX™可以单独操作，作为UHPLC色谱柱下游的唯一在线检测器，也可以与另一种检测器(如UV/Vis吸收检测器)结合使用。
可以实现高数据率扫描和低峰展宽，以确保UHPLC的改进分辨率不受影响。单独检测模式适用于不适合其他测量技术的样品，如糖在水溶液中，不挥发性溶液中，或蛋白质在吸收紫外线的溶剂中。还可以分析UV:RI比值来确定共轭分子的组成(例如蛋白质碳水化合物生物疗法)。这种额外的能力为UHPLC分析增加了重要的价值。
这个内容已经被允许转载来自Dan Some的《超高效液相色谱折射率检测的好处》，2013年。亚太生物技术新闻，第17卷第9期，第26-28页。
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