柱色谱（SEC / GPC）和MAL用于表征单体，二聚体，六烷烃和胰岛素聚集体的应用

在蛋白质和肽分析中，了解分子的低聚态有助于科学家确定蛋白质是否以其生物活性形式存在。测定低聚物状态的第一步通常是分子物种的分离和尺寸排斥色谱(SEC)表征。理想情况下，SEC根据分子的水动力体积分离分子，并根据分子的构象和化学成分相同的分子标准校准保留时间来确定摩尔质量。在许多情况下，这种分析是不成功的，要么是因为没有相关的分子标准，要么是因为分析物和柱填料之间的相互作用不理想。SEC与光散射的耦合克服了这一限制，允许洗脱大分子的摩尔质量和低聚状态的绝对表征。

多角度光散射(MALS)是测定溶液中大分子摩尔质量的第一原理方法。这种技术不需要假设分子的结构，也不需要摩尔质量标准。以往的研究也表明，胰岛素低聚物的分离SEC和检测光散射技术^1-2．此外，合成梯度MALS (CG-MALS)的测量已用于确定亲和力和化学计量的胰岛素关联^3－5．本文介绍了缓冲液组成和样品浓度对SEC偶联MALS (SEC-MALS)鉴定胰岛素低聚物的影响。

仪器仪表及实验程序

SEC使用与等级泵，自动采样器和脱气剂一起连接的Agilent 1260 HPLC系统进行。GE Healthcare的Superode 12 300/10用作分离柱。

安捷伦可变波长检测器在280nm, a黎明^®赫勒奥斯^®18角光散射探测器，和Optilab^®REX™折射率检测器用于检测(图1)^®软件用于SEC-MALS分析。

图1。分析仪器。

流动相由140mM NaCl、10mM Tris、2mM苯酚和200ppm NaN3组成，pH为7.7。分析含0.6 mM胰岛素的3种不同的胰岛素样品制剂。样品1)不添加锌的胰岛素类似物;样品2)人胰岛素0.1 mM锌;样品3)0.3 mM锌的人胰岛素。

实验结果

在没有锌的情况下，胰岛素分子形成二聚体和其他低聚物，其可以通过秒分离并通过光散射分析。图2显示了样品1的结果，其中摩尔质量在整个色谱图中表示。主要级分具有5.8kDa的测量摩尔质量，并对应于胰岛素单体。该物种从对应于具有摩尔质量〜35kDa的六聚体对应的次要分数很好地分解。此外，光散射信号表明，二次峰的测量摩尔质量包括来自单体至六聚体的一系列寡聚体 - 该结论是不能单独从UV信号中抽出的结论。应该强调的是，因为光散射对高分子量物质非常敏感，但即使存在非常小的UV信号，也可以容易地鉴定了六聚体。

图2。样品1的摩尔质量与时间的关系图。280nm处的紫外信号被绘制成叠加图。用DRI和LS计算其摩尔质量。

相比之下，样品2 (0.1 mM锌)的大部分以六聚体的形式存在(图3，蓝色)，而且有相当一部分似乎处于单体-二聚体平衡状态。样品1的低分子量峰洗脱速度略快于单体峰，且在单体和二聚体质量的跨峰范围内(~6-12 kDa)摩尔质量不均匀。

图3。样品1和2的摩尔质量与时间的曲线图（单体 - MER，二聚体，六聚体）。280nm处的紫外信号被绘制成叠加图。用DRI和LS计算其摩尔质量。

进一步添加锌(到0.3 mM)完全将平衡移向六聚体，如图3所示(图4)。此外，结果显示，在样品3中存在另一种分子物种，确定为胰岛素分子的十二聚体。虽然存在在痕量，这个峰值产生了一个明显的信号容易观察到的LS探测器。

图4。样品1和3的摩尔质量与时间的关系图。280nm处的紫外信号被绘制成叠加图。用DRI和LS计算其摩尔质量。

SEC-MALS允许对可逆自缔合的强度进行半定量估计。当蛋白质通过检测器时，增加注入柱上的体积会增加总的蛋白质浓度，从而使洗脱液的平衡向低聚物复合物转移。对于样品2和样品3，分别用50 μL或200 μL的同一样品溶液注入SEC柱，观察平衡结合的变化。

注射量的增加明显影响了样品2的平衡(图5)。随着胰岛素浓度的增加，单体-二聚体的平衡向二聚体和高阶低聚体方向偏移。当进样量为50 μL时，观察到的最低摩尔质量为~6 kDa，与单体相对应。而200µL注射剂的摩尔质量最小，与二聚体的摩尔质量一致。六聚体部分不受洗脱浓度增加的影响，没有形成更大的低聚物的趋势。

图5。样品3的摩尔质量与时间的关系图。DRI信号被绘制成叠加。紫外信号是饱和的，由于高样本负载。用DRI和LS数据计算其摩尔质量。

在样品3的情况下，基本上没有改变注射体积的效果（图6）。在0.3mm锌的存在下，该系统在其六聚体形式下“锁定”，并且在两个浓度（注射50μl）下测定相同的摩尔质量。Dodecamer的质量分数也没有增加。显然，六聚体的自我关联行为与单体的自我关联行为与单体的自我结合行为不同。

图6。样品3的摩尔质量与时间的关系图。DRI信号被绘制成叠加。紫外信号是饱和的，由于高样本负载。用DRI和LS数据计算其摩尔质量。

结论

结果清楚地显示了能力SEC-MALS不仅适用于抗体等大蛋白质，还用于分析关联现象，而且对于具有较低分子量的肽分子。由于使用蛋白质和肽用于治疗目的，因此持续增加，光散射作为强大的分子表征方法也将变得越来越重要。

参考文献

改编自“使用SEC-MALS”白皮书的“鉴定胰岛素低聚状态”P.Wahlund，D. Roessner和T. Jocks。经怀亚特科技许可转载的图表和插图。

1. M. H. Jensen，P.-o。Wahlund，J.K.Jacobsen，B.Vesergaard，M. Van de Weert，S. Havelund。（2011）。通过尺寸排阻色谱法耦合到多角光散射的长效胰岛素类似物的自我关联。“色谱”杂志B，879（28），2945-2951。

2.约纳森，S. Havelund, T. Hoeg-Jensen, D. B. Steensgaard, p . o。Wahlund, Ribel。,(2012)。超长效基础胰岛素Degludec新型牵引机制的设计。药物研究，29(8)，2104-2114。

3.阿伦·k·特里，克里斯蒂娜Fernández，艾伦·p·明顿。,(2010)。浓度梯度静态光散射表征的无锌胰岛素的ph依赖自缔合。Biophys。化学。，第148卷，28-33页。

4. Arun K. Attri，CristinaFernández，艾伦P. Minton。（2010）中性pH下Zn-insulin的自我关联：通过浓度梯度 - 静态和动态光散射研究。生物物理J.，Vol。148,23-27。

5。使用组成梯度多角度光散射技术来量化中性pH胰岛素的自我关联．

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