结合分子量和净电荷区分未修饰和污染肝素

由...赞助怀亚特科技2014年2月7日

肝素作为一种临床抗凝药物已有七十多年的历史。然而，由于某些药品批次被硫酸软骨素污染，这种分子已经受到严格审查。需要使用先进技术进行完整的表征，以确定肝素批次的特定化学成分。

电泳迁移率的测定有助于确定平均分子电荷。与分子量相结合，净电荷可以用来区分被过硫酸盐分子污染的肝素批次。鉴别是通过摩尔质量与分子电荷的比率来实现的。分子质量由SEC-MALS决定，分子电荷由电泳光散射决定。

样品制备及仪器

肝素样品在0.1M醋酸铵中溶解至终浓度~5mg/mL，然后在室温下平衡，然后开始分析。使用Wyatt进行电泳光散射(MP-PALS)分析Mobiuζ．将样品过滤至0.02μm并直接注射到Möbiuζ流动细胞中。通过动态光散射（DLS）与水动力半径同时测量电泳迁移率。用于分析的仪器如图1所示。

SEC-MALS用于确定分级和未分割的肝素样品的摩尔质量和多分散性。将未过滤的样品加载到色谱柱上，使用a测量洗脱样品的摩尔质量黎明赫勒奥马斯探测器和Optilab rEX折射率探测器．

仪表 - Möbiu？和阿特拉斯配件。

图1。仪器- - - - - -Möbiuζ和阿特拉斯配件．

虽然在未分离的肝素样品的摩尔质量中观察到细微的差异，这种差异不足以确定给定数量的肝素是否被过硫酸盐物质污染(表1)。此外，很难区分纯肝素和被过硫酸盐物质污染的样品的水动力半径。

表1。联合肝素样品的重量平均摩尔质量和Z平均水动力半径。

由于样品上的负电荷预期在超硫化物的存在下增加，因此进行电泳迁移率测量以确定净电荷是否可用于区分纯肝素和受污染的样品。图2中示出了电泳迁移率测量的特征'V图'。数据表示在30个检测器中复用的300电场振荡的平均值。

供应商1未分离肝素的电泳迁移率数据。

图2。供应商1未分离肝素的电泳迁移率数据。

负电泳移动性(µ)来自肝素样品的负净电荷。由电泳迁移率和水动力半径确定净电荷和zeta势。表2总结了未分级肝素样品和分级肝素标准品(NHP)的这些参数。

表2。移动，有效充电，Zeta电位，用于联合肝素样品的流体动力学半径和分级标准。

	流动性((µm 厘米)/ (s V))	有效电荷(Z *)	电动电势(mV)	R._H(nm)
联合肝素，供应商1	-1.00±0.05	-7.1±0.40	-16.9±0.9	2.30±0.02
联合肝素，供应商2	-1.18±0.09	-9.3±0.64	-19.5±1.5	2.48±0.01
超硫酸肝素，供应商2	-1.46±0.12	-11.2±0.96	-23.8±1.9	2.49±0.02
NHP III	-0.42±0.03	-3.2±0.26	-7.9±0.57	2.19±0.02
NHP IV.	-0.65±0.10	-4.2±0.56	-11.8±1.7	2.09±0.02
NHP VI.	-0.86±0.05	-7.1±0.39	-15.8±0.9	2.43±0.02
额定马力七世	-0.85±0.10	-14.2±1.8	-14.2±1.7	3.74±0.03

如预测的那样，超硫酸盐物质在三种未分离肝素样品中表现出最大的净电荷。但是纯硫酸盐样品和过硫酸盐样品之间的费用偏差与两个供应商的费用偏差是相同的。这种偏差可能仅仅揭示了摩尔质量或多分散性的差异，从而表明仅靠净电荷不足以确定不同批次的肝素。

然而，当电荷和质量同时考虑时，纯肝素样品可以明显地与过硫酸盐样品区分开来(图3)。纯肝素的校准曲线使用分离的肝素标准品的摩尔质量和净电荷(NHP III, IV, VI，这四个样品的净电荷与纯肝素的摩尔质量呈线性关系，代表恒定的电荷与质量比。

测量的肝素标准品的净电荷和摩尔质量呈线性关系，表明电荷质量比恒定。

图3。测量的肝素标准品的净电荷和摩尔质量呈线性关系，表明电荷质量比恒定。

在他们测量的基础上_W.，供应商1和供应商2的未分馏肝素净收费在预期值的2%范围内。相反，供应商2所测的超硫酸盐肝素净电荷大约比该规格肝素的期望值高30%。

从这些结果可以明显地看出，有效分子电荷可以通过电泳迁移率和水动力半径的同时测量快速和非破坏性地表征。负电荷的增加，通过电泳迁移率的变化来定量，是随着修饰肝素样品中硫酸盐基团的增加而恒定的。

与污染样品相比，将测量的摩尔质量和测量的每个肝素样品的测量电荷产生纯肝素的特征指纹。有效充电的明显歧视：未改性和超硫酸化肝素之间的质量比是指该值可以用作鉴定不同肝素样品的指标。

改编自“通过电荷:质量比区分肝素和硫酸软骨素”，索菲亚·肯瑞克博士白皮书。经怀亚特科技许可转载的图表和插图。

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