用µDAWN和OPTILAB UT-REX测量超高性能液相色谱中的绝对摩尔质量

尺寸排除色谱（SEC）是表征生物分子样品中片段和聚集体的常见技术。理想情况下，SEC的洗脱受水动力半径而不是摩尔质量控制。传统的SEC取决于参考标准，以便校准圆柱洗脱时间与摩尔质量的函数，假设感兴趣的分析物具有与标准品相同的构象和化学组成。

然而，现实世界样品的分离通常不能按照这些标准准确地表示。即使构象与标准标准相似（很少是这种情况），实际样品也可能表现出相对于标准的柱相互作用，从而改变其洗脱性能。当SEC与像Minidawn™Treos这样的光散射检测器耦合时^®，无论洗脱时间如何，它都可以绝对量化分子的摩尔质量。

超高性能液相色谱（UHPLC）

UHPLC促进了生物分子样品的快速，有效分离。UHP-SEC比标准SEC具有多个优点，例如更高的吞吐量，改进的分辨率，溶剂较少的消耗量和较小的样品体积，用于分析有价值的生物样品。由于分散过多，用于标准HPLC的检测器不能用于UHP-SEC。怀亚特µDAWN^TM值多角度光散射（MALS）检测器（图1）和OPTILAB^®UT-REX^TM值折射率（RI）检测器专为UHPLC应用而设计。这种组合能够测量UHPLC中的绝对分子量（或摩尔质量）和洗脱物种的大小。

图1。Wyatt µDAWN MALS检测器。

用µDAWN和OPTILAB UT-REX的UHPLC分析的优点

与传统的HPLC相比，要完成整个UHPLC分析（图2，红色）（图2，蓝色），需要少于5分钟，这通常需要每个样品30分钟或更长时间。在这两种情况下，MAL都测量了光散射强度和RI浓度，用于计算每个峰的摩尔质量。

图2。光散射数据和测量的摩尔质量，用于通过UHPLC分离的蛋白质，并使用标准HPLC分离的µDAWN和UT-REX（红色）（红色）覆盖，并用Minidawn Treos和Optilab T-Rex（蓝色）检测到。

图2通过Minidawn Treos和Optilab T-Rex测得^TM值对于标准的sec-mal，以及用于UHPLC-SEC-MALS的µDAWN和OPTILAB UT-REX。图2中的顶部图将色谱图描述为洗脱时间的函数。在图2的底部图中重新缩放了相同的数据作为列音量的函数，以促进比较。对于每个峰值，摩尔质量的完美一致性揭示了将现有的HPLC技术迁移到UHPLC的可能性，而不会损害分子量数据的准确性和质量。

除了缩短分析时间外，珠子大小低于2 µm的UHPLC固定相还可以改善聚集体和片段峰的分辨率。由于内部体积大的标准柱和检测器引起的分散体扩大了这些微小的峰，从而导致某些溶解不良的物种的“消失”，例如图3所示的片段为蓝色痕迹。

图3。光散射数据和测量的摩尔质量，用于与标准HPLC分离的UHPLC（红色）分离的蛋白质（红色）。

µDAWN经过设计最少的内部体积，以维持UHPLC洗脱剖面中的分辨率，从而促进了对先前未知物种的检测和研究。图3中的框显示了只能通过UHPLC分离的片段峰。图3中的底部图显示了一个放大视图，显示了片段及其摩尔质量，如µDAWN所测量。

RI检测大大增强了片段分析，RI检测是一种普遍适用的在线浓度测量方法，仅取决于分析物相对于溶剂的折射率增量（DN/DC）。对于所有蛋白质，折射率增量实际上都是恒定的。因此，与基于紫外线的浓度测量值不同，不必确定片段的身份以确定峰的灭绝系数，以量化洗脱浓度和摩尔质量。实际上，可以使用紫外线和RI检测的组合来了解每个物种的灭绝系数并帮助其识别。

结论

µDAWN不仅测量了绝对分子量，而且还提供了用Minidawn Treos对UHPLC进行的所有深入分析。与标准的HPLC-MAL一样，UHPLC-MALS峰值测量生物聚合物的多分散性或验证可逆蛋白质低聚的摩尔质量的变化。用紫外线，mal和RI进行三重检测促进蛋白结合分析，以确定翻译后修饰，相关洗涤剂，药物偶联物或其他对多肽背景的添加程度。

µDAWN复制了三角米德拉（Minidawn）可用的10-50 nm RMS半径（RG，旋转半径）。此外，WYATTQELS™模块可选的动态光散射（DLS）检测可在与MALS检测的相同测量量中量化0.5至40 nm的流体动力半径。

参考

改编自Wyatt Technology制作的白皮书。在Wyatt Technology的许可下重印的图形和插图。

此信息已从Wyatt Technology提供的材料中采购，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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