使用组合技术表征蛋白质聚集体

作为动态和静态光散射（DLS和SLS）系统，Zetasizer„ V可以在批处理比色杯中测量分子大小和分子量，以及与配备有omniface连接盒的尺寸排斥色谱（SEC）系统结合使用（图1）。

Zetasizer“ V具有较高的信噪比，90°检测角以及可变的功率激光器和衰减器，可提供与光散射计数速率有关的广泛动态范围。

图1。Zetasizer µV和Omniface A/D转换器盒。

另外，具有很小的光散射体积，Zetasizer„ V可以测量很小的样品。使用批处理，该系统可以在小至2ìl的情况下进行测量，而音量仅为8ìl，带有流动池。在批处理和色谱模式之间更改也只需要几秒钟。

Zetasizer„ V主要用于蛋白质表征，本文证明了Zetasizer„ V在批次和色谱模式中测量两种蛋白质的应用。

实验结果

批次DLS测量

首先，测量了BSA蛋白，其批次DLS测量如图2A所示。峰的存在表明该蛋白质是非常干净的样品，没有任何聚合材料。

峰值的Z平均半径为3.7 nm，值略高于纯BSA单体。此外，确定的多分散指数（PDI）为0.16，表明人口略有聚散异。

但是，基于比色杯的批处理DLS测量无法解析单个低聚物，因此提供了一个具有较高多分散性的单个峰。

BSA样品测量以色谱模式

使用配备第三方紫外线（UV; Purple）和折射率（RI; RED）检测器（图2C）的Zetasizer“ V，以色谱模式测量相同的BSA样品（图2C）。

SEC中的分子分离是以最小的最后一个方式进行的。峰的分子量表明主峰是单体，而次级峰是二聚体，二聚体峰的前缘的肩膀是修剪器（图2B）。

图2C描绘了三个峰的测得的半径分别为3.5、4.5和5.4 nm。SEC的分辨率允许测量每个人群。基于单体和二聚体峰内的分子量和大小的稳定性，每个峰代表蛋白质的一种形式（图2B）。

少量低聚物的共同统治以少量代表三聚体尾巴的向上肩部表示。蛋白质样品中二聚体和三聚体的比例略低于10％。与纯单体相比，这两个人群的贡献阐明了批次DLS测量中获得的Z平均值稍高。

图2。A.批次DLS测量BSA。B.分子量覆盖的BSA的衍生色谱图。C. BSA的原始色谱图。

- 乳球蛋白是测量的第二个蛋白质，其批处理和色谱测量如图3和4所示。

图3A显示了通过0.02ìm滤波器过滤前进行的批次DLS测量。在三个重复测量中观察到一致的人群一致，半径为2.8nm，清楚地表明人群是 - 乳球蛋白。

在测量值中观察到的额外峰范围从30 nm到1ìm的尺寸，表明样品中存在聚集的材料。大约100 nm的Z平均样品为0.08，代表聚合材料的贡献。过滤样品的Z平均为2.8 nm，PDI为0.07，揭示了通过样品过滤消除聚合的材料。

图3。A.未经过滤的 - 乳球蛋白的批量测量。B.过滤的 - 乳球蛋白的批次测量。C.带有分子量覆盖的色谱图。

未经过滤样品的SEC测量如图4所示，清楚地显示了两个峰。18 mL后洗脱峰的分子量决定了这一峰为 - 乳球蛋白。

分子量和大小的低多分散性表明这是蛋白质的稳定形式。峰内的大小（图3C）和分子量（图4）的偏差表明与低聚物相比，蛋白质聚集体的预期高不稳定性。

图4。DLS半径覆盖的原始色谱图。

结论

Zetasizer„ V可以在批处理和色谱模式下测量分子尺寸和重量。DLS很简单，很快，可提供小样品体积中蛋白质的无创尺寸测量。它对较大物种的敏感性使其适合确定样品中聚集物质的存在。

可以使用SEC分离多分散样本中的个体种群。SLS和DLS的组合可以测量种群的大小和分子量，从而促进了寡聚状态的表征。

此外，可以量化批次DLS测量中确定的聚合材料的量。

此信息已从Malvern Panalytical提供的材料中采购，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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