利用拉曼光谱监测分子振动，获得蛋白质二级和三级结构的信息。
动态光散射或DLS有助于确定生物治疗蛋白在溶液中的流体力学直径，以及它们的多分散性和相互作用。
通过将这两种分析方法结合到一个系统中，可以确定大量的结构、化学和物理参数。可确定的参数包括:
- 熔化温度
- 聚集起始温度
- 转变焓值
- 蛋白质二级和三级结构
- 聚合的倾向
- 蛋白质溶解度
- 在配制的浓度下具有高粘度的潜力
本文列举了拉曼光谱在理解蛋白质治疗的构象稳定性方面的作用。
的方法
的Zetasizer Helix (ZS Helix)Malvern Panalytical公司将光纤耦合拉曼光谱仪与Zetasizer纳米ZSP相结合，在单个样品上提供DLS的胶体稳定性和Raman的构象稳定性。
采用Zetasizer纳米技术，结合了静态或SLS、动态或DLS和电泳或ELS光散射与非侵入性后向散射(NIBS)探测器技术，可以从0.15 nm到5µm和0.1 mg/mL到≥100 mg/mL测量蛋白质的流体力学半径。
从150 cm激发785 nm (~280 mW)－1到1925厘米－1在4厘米－1进行了喇曼光谱的采集。样品等分(~120µL)被放置到3mm石英试管中，并放置在温控室中，温度控制从0°C - 90°C±0.1°C。
通过在一系列预定义的0.1°C - 5°C的步进增量上收集DLS和拉曼数据，进行热斜坡研究。一系列DLS和拉曼数据在预先设定的时间间隔内，在所需的温度设置进行等温培养研究。
结果与讨论
利用拉曼光谱可以有效地测定蛋白质的二级结构特征。提出了几种二级结构确定算法，包括:
- 一个特别信息丰富的光谱特征称为酰胺I波段的波段反褶积
- 多变量建模方法，包括从990厘米宽的光谱范围－1到1730厘米－1．
由C=O拉伸结合少量C- n拉伸，酰胺I带~1600 cm－1到1700厘米－1是获得。从耦合的C-N拉伸到N-H弯曲，酰胺III特征，~1200厘米－1到1340厘米－1是获得。在约930厘米处的一条带－1到950厘米－1是基于n - c - α- c骨架拉伸模式，其强度与α-螺旋含量有关。这些特征是蛋白质二级结构的关键特征带，表1总结了这些特征带。
表1。拉曼位移与蛋白质二级结构的关系。
| 拉曼位移(cm－1） |
蛋白骨干 |
二级结构的主题 |
| 1670 - 1680 |
酰胺我 |
ß词/随机ß讨论 |
| 1660 - 1670 |
酰胺我 |
ß表 |
| 1650 - 1655 |
酰胺我 |
α螺旋 |
| 1330 - 1340 |
酰胺三世 |
α螺旋 |
| 1235 - 1250 |
酰胺三世 |
ß表 |
| 930 - 950 |
骨骼拉伸 |
α螺旋 |
图1为热处理前后牛血清白蛋白(BSA)具有代表性的拉曼光谱，说明了所描述的主要二级结构特征。
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图1所示。BSA (pH 7.4时50 mg/mL, PBS缓冲液)的拉曼光谱分别在20℃和90℃下采集。
然而，在多元方法中，整个光谱轮廓被认为不仅仅是一个单一的拉曼波段或频率。表2的数据显示了可以从该模型自动获得的结构信息的类型，以及与www.pdb.org报告的值的比较。
表2。二级结构基序来自多元拉曼分析。
| 蛋白质 |
PDB文件 |
多变量模型值 |
PDB的价值 |
|
|
α螺旋 |
ß表 |
α螺旋 |
ß表 |
| 伴刀豆球蛋白一 |
3 cna |
0 |
46 |
0 |
40 |
| 胰蛋白酶 |
3 rn3 |
18 |
33 |
20. |
35 |
| 溶菌酶 |
7 lyz |
28 |
8 |
39 |
10 |
| 人血清白蛋白 |
1 ysx |
69 |
0 |
67 |
0 |
与PDB的报道值比较。
图1所示的同一组BSA数据中，通过多元模型预测的α-螺旋和β-薄片含量作为温度的函数在图2中进行了比较。
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图2。图1所示为同一BSA样本的多元分析预测的二级结构变化。
三级结构
拉曼光谱已被用作蛋白质三级结构的探针，对芳香侧链，即苯丙氨酸(Phe, F)、酪氨酸(Tyr, Y)和色氨酸(Trp, W)的对称振动模式也高度敏感。
整理主要的三级结构带分配及其相应的结构指示，如表3所示。
从图3可以清楚地看出，随着温度的升高，二级结构(绿圈)由α-螺旋结构丰富变为β-薄片结构丰富，α-螺旋结构从40%下降到18%，β-薄片结构从6%增加到28%。
表3。常用的用于蛋白质三级结构的芳香标记综述。
| _1喇曼位移(cm) |
源 |
结构说明 |
| 1360/1340 > 1 |
色散费米双重态(W7) |
吲哚环在疏水环境或与脂肪链接触 |
| 1360/1340 < 1 |
色散费米双重态(W7) |
吲哚环在亲水环境或暴露在水介质中 |
| 1550 |
二面角(W3) |
吲哚环与肽键平面之间的夹角 |
| 870 - 885 |
Trp氢键(W17) |
883年非H-bonded
877年中等强度
871强H-bonded |
| 760 |
Trp (W18) |
Cation-n交互 |
| 850/830 ~ 0.25 |
H-bonding的酪氨酸 |
强氢键供体 |
| 850/830 ~ 1.25 |
H-bonding的酪氨酸 |
强氢键给体和受体/暴露于水环境 |
| 850/830 ~ 1.25 |
H-bonding的酪氨酸 |
强氢键/埋藏酪氨酸的受体 |
| 1002 - 1004 |
环式呼吸方式 |
归一化拉曼强度 |
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图3。热处理前后pH为7.4的溶菌酶的代表性光谱。黑色圆圈表示表3所示的芳香标记物，绿色圆圈表示表1所示的二级结构。
二硫键
二硫键是半胱氨酸残基上硫单元之间的共价键，对维持蛋白质的天然结构至关重要。表4显示了三种独特的二硫键构象。
表4．拉曼光谱中二硫键构象的综述。
| 拉曼位移(cm－1） |
源 |
结构说明 |
| 508 - 512 |
s拉伸 |
GGG构象异构体 |
| 523 - 528 |
s拉伸 |
GGT构象异构体 |
| 540 - 545 |
s拉伸 |
TGT构象异构体 |
热处理前后溶菌酶的二硫区或四个总二硫键如图4所示。从508厘米处可以看到－1、528厘米-1、545厘米－1．
在20℃时，溶菌酶二硫键具有gauchegauche- gauche-gauche-trans(GGT)、gauche-gauche-trans(GGT)和trans-gauche-trans(TGT)构象的特征。可以观察到，在80°C时，峰值在528 cm处－1和545厘米－1都消失了，这表明只有GGG构象还存在。
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图4。20°C和80°C溶菌酶的拉曼光谱(二硫谱区)(左)和40°C溶菌酶样品(右)DTT (50mg/mL蛋白50mm DTT)。
附加拉曼光谱-蛋白质结构的应用
在蛋白质治疗中，拉曼光谱具有重要的应用前景。它有助于取样，坚固性和选择性，并有许多未来的应用可能，如法医粒子识别(硅油滴，玻璃等);界面蛋白质结构测定(水、油、金纳米颗粒);欧洲杯猜球平台蛋白质动力学(H/D交换);加速降解(热、还原剂、搅拌和氧化)等。
结论
将DLS和拉曼光谱结合到一个单一的仪器平台上，提供了独特的分析能力，可以在不改变测试条件的情况下，确定同一样品的蛋白质二级和三级结构、熔化温度、大小和聚集开始。
本文列举了利用拉曼光谱可以关联的独特的光谱结构性质。并用DLS计算得到配方稳定性的体积粘度/限制扩散相互作用参数kD、颗粒相互作用参数B22、熔点温度、聚集起始温度和过渡焓。
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这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．