蛋白质结构的确定和稳定性通过结合动态光散射和拉曼光谱

在蛋白质配方,天然态演变和聚合主要意义对于病人和制造商。更好的理解聚合因此要求提高产品质量和减少安全隐患,以及仔细的监测对于相关问题制定的长期稳定。

的结合动态光散射(DLS)和拉曼光谱适用于调查蛋白质聚合。在拉曼光谱中,蛋白质发生派生通过监测信息的修改在分子振动的发生是由于蛋白质的二级和三级结构的变化。

另一方面,DLS技术用于确定样本的多分散性,治疗性蛋白的水力半径解决方案以及样本的交互。

蛋白质展开/聚合途径

将这两种分析技术集成到一个系统,一系列物理、结构和化学参数可以确定。二级和三级结构的蛋白质,出现聚合温度(T_发病)、熔化温度(T_米),转变焓值、蛋白质溶解度、聚合的倾向,和潜在的高粘度浓度可以制定。

获得的结果从拉曼光谱和DLS相同的样本可能会给独特见解展开和聚合的机制。

Zetasizer纳米系统

同时为了获得拉曼和DLS测量,Zetasizer螺旋(z螺旋)莫尔文Panalytical集成与光纤耦合Zetasizer纳米ZSP拉曼光谱仪提供拉曼(构象稳定性)和DLS(胶体稳定性)序列在一个样本的数据。

Zetasizer纳米系统结合了非侵入性的后向散射(上司)探测器技术和电泳(ELS),静态(SLS)和动态光散射(DLS)来确定蛋白质的水力半径从0.3 nm 10µm,在浓度从0.1毫克/毫升到100毫克/毫升,或者更多。

使用785 nm激发(~ 280 mW)从150厘米¹到1925厘米¹在4厘米¹分辨率,拉曼光谱进行收集和使用石英试管3 mm路径长,样本整除(~ 120µL)介绍了温度控制的样品室。样品室的温度可以设置从0°C到90°C±0.1°C。

热坡道研究由收集DLS和拉曼数据在一系列预定义的温度增量,而等温孵化实验是由收集DLS和拉曼数据在较低的温度下,迅速增加温度,和收集各种DLS和拉曼数据在更高的温度在很长一段时间。

拉曼光谱

拉曼光谱提供了一种有效的方法来确定蛋白质的二级和三级结构特点。广泛的二级结构标记,包括一个螺旋骨干(930厘米¹- 950厘米^{- 1}我(1600厘米),酰胺¹- 1700厘米¹)和酰胺三世(1200厘米¹- 1350厘米¹)可以被监控。

拉曼光谱是非常敏感的芳香族侧链的振动模式,如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。因此它被广泛用于探测蛋白质三级结构。

许多行之有效的拉曼标记提供洞察这些芳香族侧链的环境,包括酪氨酸在1550厘米¹在850厘米和酪氨酸¹。在这些领域的更改意味着改变侧链的疏水或亲水环境,这是典型的展开。

由于拉曼光谱能够阐明蛋白质的结构变化,适用于研究展开的蛋白质。当蛋白质暴露在热应力,他们展开和聚合。图1显示了溶菌酶样品的拉曼光谱,它受到热应力在20°C(蓝线)和80°C(红线)。

图1所示。拉曼光谱的溶菌酶(蓝线)之前和之后(红线)热处理。变化在二级(绿色圆圈)和三级(黑色圆圈)结构标记观察由于热应力。

动态光散射

从历史上看,DLS用于水力半径的确定蛋白质在溶液中与反向散射探测的包容,但现在在溶液中蛋白质的大小可以被探测到。除了尺寸测量,DLS提供信息样本的多分散性或大小分布,可以用来量化T_发病。

由于其灵敏度大小、DLS是完美的检测微量的大骨料的解决方案。结果从牛血清白蛋白(BSA)热增加实验如图2所示。

图2。DLS热增加50毫克/毫升BSA的数据。结果包括Z-average大小、PDI和体积和强度分布。

在图2中,Z-averaged大小趋势(蓝线)表示,T_发病~ 62°C。强度和体积分布(嵌入)显示,随着温度的增加,仪器检测到的更大的粒子的数量也增加了。欧洲杯猜球平台特别是,有大颗粒的增加约为60°C(紫色线,插图)。欧洲杯猜球平台

这些增加表明,总量也开始形成。此外,多分散性开始增加55°C,表示聚合开始发生在温度。

DLS和拉曼光谱

DLS和拉曼的结合导致了法,适用于监测蛋白质和聚合途径展开。例如,研究蛋白质之间的关系展开和聚合配方BSA的柠檬酸缓冲在不同的小灵通。

样本生产50毫克/毫升浓度在pH = 4.7, 5.4, 7.1。对于每一个样本,转变温度(T_米)是由执行增加实验。这之后,样本孵化略低于他们的T_米展开应该是期望状态但发生缓慢。

图3显示了代表等温孵化研究结果。

图3。代表结果Raman-DLS BSA的研究在不同的pH值。

左上角的面板图3显示变化的程度在pH值7.1 BSA样本60°C之间的孵化t = 0(蓝色)和t = 7.8小时(红色)DLS结果(嵌入)和我带的酰胺。

右上角和左下角的面板显示的完整分析拉曼(酰胺I)和DLS数据,分别。的研究表明大量pH-dependence BSA展开和聚合的行为。

在图3中,右下角的面板Z-averaged大小和时间依赖性的酰胺我带重叠。这图显示的大小和结构变化密切跟踪。它还表明,蛋白质的结构展开追踪拉曼光谱结果在一个更大的BSA单体,轻微的BSA的聚合发生。

通过观察结果不同的图片显示在pH值为5.4,当蛋白质的结构变化是极其微小的(~ 0.25厘米¹改变后7.8小时),但规模变化相当大(大于500海里后7.8小时)。

pH值4.7结果显示一个细微的变化在大小50°C和结构没有明显变化。蛋白质出现沉淀立即60°C T以上_米BSA的pH值4.7。这个比赛预期π,附近聚集可以自由形式和电荷斥力的蛋白质单体不存在。

结合DLS /拉曼光谱提供了洞察如何访问规模以及结构数据可以利用更好地理解流程分析感兴趣的社区。

结论

通过结合DLS和拉曼光谱成一个单一的系统,蛋白质的大小和结构变化从一个示例可以确定。拉曼光谱,其监测蛋白质结构变化的能力,是蛋白质的良好指标展开和潜在的聚合和DLS,确定蛋白质的大小变化的能力,也是一个很好的指示器的蛋白质聚合。这些分析方法可以提供一个更好的了解展开和聚合通路,提供重要的特征信息。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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