在蛋白质制剂中，天然状态展开和聚集对患者和制造商来说至关重要。产品质量和安全问题需要了解聚合变化以及对可能直接受到制定稳定性影响的长期问题的仔细监测。
动态光散射是一种众所周知的技术，用于表征悬浮液中纳米级材料的流体动力半径。欧洲杯足球竞彩拉曼光谱是另一种普遍的技术，提供有关蛋白质配方的完整结构信息。
研究结合拉曼光谱和DLS是理想的与蛋白质解折叠同时调查聚集现象，特别是当这些分析方法被集成在一个单一的系统。若干机制已经提出了在高温下与孵化描述蛋白质制剂的行为作为时间的函数，通常作为用于长期存储的代理。
这篇文章描述了温度升高孵育的时间依赖性，不同的ph DLS将用于监测BSA配方的聚集演化，而拉曼光谱将用于跟踪蛋白质的展开，所有这些都在一个单一的实验中。
方法和材料欧洲杯足球竞彩
纤维耦合拉曼光谱仪被整合到Malvern截止laizer纳米（ZSP）中，以在单个样品上依次获得拉曼（构象稳定性）和DLS（胶体稳定性）数据。Zetasizer Nano System用电泳（ELS），静态（SLS）和动态（DLS）光散射集成了非侵入性反向散射（NIBS）检测器技术，以便在浓度测距下测定0.15nm至5μm的蛋白质的流体动力半径从0.1mg / ml至> 100mg / ml。
使用785 nm (~350 mW)激励，从150 cm－1到1925厘米－1以4cm－1进行拉曼光谱分析。然后，在pH为5.4、7.1和4.75的柠檬酸缓冲溶液中制备浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白样品，分别涵盖略高于等电点、显著高于等电点和接近等电点的环境范围。
然后样品等分试样（〜120μL）置于3毫米石英比色皿内并定位在隔室提供温度从0℃至90℃±0.1℃。
结果与讨论
DLS和拉曼光谱数据
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图1。在25°C（蓝线）和85°C（红线）代表的拉曼光谱为BSA在pH值7.1的制剂。
当从25℃加热至85℃，如在酰胺I（〜1650厘米为在25℃和85℃的pH值7.1的样品的代表性的拉曼光谱示于图1中的拉曼光谱，发生显著变化－1)和酰胺III (~1250cm－1）频段。
这些特征指向BSA和展开蛋白质的二级结构的改变确认随着温度增加。类似地，尺寸数据显示从〜7nm的（25℃）至35纳米（85℃）的强移作为温度的函数。该结果表明在55℃下相当大的聚集蛋白质。
过渡温度的测定
孵育低于转变温度（TT.)，以确定一个需要聚合的非平衡状态，并可实时跟踪该过程。进行了一系列的温度爬升实验，以建立TT.在感兴趣的pH。所得到的拉曼和DLS过渡曲线被适用于每个配方，以确定它们对应的tT.值。每个公式的转换结果如图2所示。
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图2。蛋白质过渡曲线作为温度的函数，用于pH 7.1（蓝色），pH5.4（红色）和pH 4.7（绿色）。α-螺旋至β-片转化显示为pH 4.7结果的插图。
在图2中，结果显示了T的变化T.作为pH的德。最重要的是不同样本之间的转变温度的变化：pH 4.7显示最低的tT.， pH值为5.4的样品表现出最高。插图显示了pH值4.7样品的全光谱范围PLS预测。
该曲线还预测BSA中的α-螺旋和β-片状结构作为温度的优点。随着获得BSA的转变温度，α-Helix的量似乎很快减少，表示BSA展开。
两个大小衍生T的结果T.和TT.由酰胺I和酰胺III光谱区域确定在表1中。
表1。转变温度（TT.）来自DLS尺寸数据（Z-平均）和各种BSA制剂的拉曼光谱分析。
| BSA |
尺寸（nm） |
酰胺我(°C) |
酰胺III（℃） |
| pH值7.1 |
64.5 |
64.8 |
64.6 |
| pH 5.4 |
64.4 |
66.1. |
66.6 |
| PH 4.7. |
56.5 |
59.6 |
59.6 |
因此，取决于溶液的pH值，TT.BSA的变化范围从59°C到65°C。
BSA聚合动力学
基于表1所示的结果，60℃下被表示为起点到检查这些BSA制剂的聚集动力学。然后将各制剂在60℃下温育，以被收集的拉曼和DLS数据依次每隔5分钟。该实验在60℃下进行BSA在pH 4.7显示“片状”白色材料的快速沉淀;在这些条件下BSA聚合比可以测量快。收集pH值5.4，并在60 7.1制剂中的DLS数据和拉曼光谱数据℃的总结在图3。
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图3。背景校正的拉曼分光对BSA的制剂数据（酰胺I带）和DLS结果，在pH 5.4和7.1下温育在60℃下。零时间以蓝色表示，孵化的红色完成。
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图4。在pH 7.1 - 7.7小时的60°C孵育下，BSA的Amide I峰位置和Z-Average尺寸随时间的相对变化。
此外，尺寸和展开动力学密切跟踪彼此为pH值7.1的样品（图4），表明蛋白解折叠和聚集是同时在远离等电点的点。
因此，独特的行为被观测到低于转变温度量化两个样本。在pH 7.1，远离等电点时，蛋白质的解折叠是由BSA的Z均尺寸跟踪。这表明该蛋白解折叠到非常大的尺寸，但基本上不聚集。在pH值为5.4，接近等电点，蛋白质聚集到非常大的规模，但没有展开。
结论
拉曼光谱的组合DLS提供了在分子结构的变化中同时量化大小变化的能力。该组合方法描述了单一实验中的蛋白质展开动力学和聚合行为，从而提高了对这两个过程之间的相互作用的理解。
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此信息已经来源，审议通过马尔文PANALYTICAL提供的材料改编。欧洲杯足球竞彩
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