使用DLS /拉曼光谱学调查单克隆抗体的热稳定性

在生物制药产品的开发,热稳定性的表征是一个关键的步骤优化单克隆抗体(mab)及其配方。标准技术用于描述热行为被称为差示扫描量热法(DSC)。这种技术提供了一种电热稳定性和热力学性质可以派生。

为了减少聚合在加热、DSC样本通常是运行在低浓度,因此这种技术并不是有效的测试浓度更高的稳定性,制定产品的特点。假设聚合不发生由于低浓度样品加热;然而,没有办法证明这个从获得的数据,并与视觉样本聚合的迹象通常DSC运行的最终产品。

的结合拉曼光谱和动态光散射(DLS)使热稳定性的分析从聚合配方浓度和有助于区分展开活动。

马伯的二级结构是相当稳定的结构框架p-sheet丰富,与二硫化共价债券呈现进一步稳定。因此,热应力本身并不足以扰乱二级结构。本文比较了热稳定性的修改单克隆抗体(mmAb)和相关模板单克隆抗体(mAb)的修改进行了。

方法和材料欧洲杯足球竞彩

Zetasizer螺旋(z螺旋)莫尔文Panalytical包含一个光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供拉曼(构象稳定性)和DLS(胶体稳定性)序列在一个样本的数据。Zetasizer纳米系统集成了非侵入性的后向散射(上司)探测器技术和电泳(ELS),静态(SLS)和动态光散射(DLS)为了确定蛋白质的水力半径0.15 nm 5µm, 0.1毫克/毫升大于100毫克/毫升。使用785 nm激发(~ 280 mW)从150厘米¹到1925厘米¹在4厘米¹分辨率,收集拉曼光谱。

马伯和mmAb准备在10毫米50毫克/毫升缓冲区在pH值为5.5。样本保持在4°C,直到进行了研究。样本整除(~ 120µl)被引入一个3毫米石英试管和放置在一个舱提供温度控制在0°C到90°C±0.1°C。

热坡道研究然后由收购DLS拉曼数据一组预定义的0.1°C - 5°C步进式增量。接下来,等温孵化所进行的研究获得一组DLS和拉曼数据在一个预定义的时间间隔在首选的温度点。

结果与讨论

拉曼光谱

加热马伯和mmAb样本后,通过检测其大小和结构特点拉曼和DLS在整个实验过程。图1显示马伯的拉曼光谱和mmAb样品在高温和低温,并证实了分子的二级结构的稳定性。这些构象相关光谱区域,特别是酰胺我和第三区域,不显示相当大的峰值变化或修改,但我表现出轻微的频带拓宽酰胺地区。

图1所示。代表拉曼光谱单克隆抗体(A)和(B)修改版本之前和之后的热应力。

马伯/ mmAb的二级结构可以用偏最小二乘建模分析,从参考蛋白获得的光谱样本与已知使用二级结构元素来预测未知蛋白质的二级结构样本。

图2说明了温度依赖的四个结构图案的预测模型:p-sheet, p-turn、一个螺旋和无规卷曲马伯(图1)和mmAb(图1 b)。尽管小谱和结构性变化的观察,可以看到mmAb和马伯表现出不同的行为(图2)。

图2。预测二级结构比例为单克隆抗体(A)和(B)修改版本的函数增加温度。不同颜色的痕迹显示不同的结构元素的变化。

在图2 C, mmAb显示较低的起始温度与双过渡~ 50°C和65°C,分别同时马伯显示一个突然的转变接近70°C。这表明mmAb马伯对热应力的反应不同,尽管这不是直接比较明显的光谱。

有趣的是,酪氨酸和色氨酸马伯,mmAb显示相当大的差异。如图3所示,光谱之间的二面角标记表明色氨酸的肽键平面侧链和吲哚环显示急剧转型的马伯~ 69°C。然而mmAb早期发病在~ 66°C和转型是非常广泛的。

图3。光谱的峰值位置安装指示性标志之间的二面角色氨酸的吲哚环和肽键平面侧链(一个);光谱标记描述Hbonding环境酪氨酸的侧链(B)。

额外的差异是观察到在图3 b中,光谱的标记描述氢键环境酪氨酸侧链的绘制。马伯再次显示了一个急剧转型的~ 69°C。

然而,mmAb跟踪显示双过渡,在拐点~ 53°C和~ 62°C。这个观察和二级结构的构象稳定性观察,表明酪氨酸侧链可能会导致早期的构象变化导致较低的热稳定性。

动态光散射

虽然拉曼光谱提供洞察结构变化,它并没有解决尺寸变化引起的聚合和热应力期间展开。拉曼和DLS有助于研究结合的方法这两个重要特征在同一时间。

图4。Z-average大小(A)和多分散性指数,PDI (B)由动态光散射(DLS)策划的单克隆抗体(蓝色跟踪)及其修改版(红色痕迹)作为温度的函数。

图4马伯的爆发表明,聚合发生在更高的温度相比mmAb,再次表明其热稳定性高。mmAb显示与观察到的拉曼数据相同的双重转型,尤其是对酪氨酸H-bonding环境。

DLS Z-average大小数据显示,温度较低的过渡是一个寡聚化活动~ 50°C,而更高的温度过渡mmAb (~ 65°C)是一个快速聚合的事件,mAb的观察样本> 70°C。

在图4 b中,PDI趋势是一致的。马伯的样本,PDI变化约为0.1,直到一个增加主要是观察到~ 60°C。这表明mmAb样本形成低聚物在最初的过渡,这些寡聚物依次形成大骨料中指定的第二次转型。这些观察结果与上面描述的拉曼数据一致。

DLS技术不仅决定了大小本身,也决定了大小分布,这是不可能的或静态光散射浊度测量。

等温孵化

上述结果表明,变化的热稳定性资料mmAb和马伯将齐聚反应引起的mmAb三级结构的展开。然而,这一过程的动力学和寡聚物的稳定性仍不清楚。为此,等温孵化项目在pre -过渡(46°C),转型期(53°C)和post (60°C)的温度进行过渡。结果如图5所示。

图5。等温孵化研究mmAb Z-averaged大小来自DLS数据(A);酪氨酸峰值位置(B);(C)和色氨酸峰值位置。并给出了不同的孵化温度为蓝色(46°C),红(53°C),和绿色的痕迹(60°C),策划作为时间的函数。

大小逐渐增加孵化时达到的温度;色氨酸和酪氨酸喇曼制造商乐队不显示任何相当大的峰值变化。然而,在53°C,规模迅速增加从10 ~ 35 nm,然后稳定下来。同时,酪氨酸峰值位置下降,而色氨酸峰值位置移动。

这些观察再次支持修改或新增的酪氨酸残基的想法导致齐聚在较低的温度,最终导致mmAb较低的热稳定性。

结论

DLS的结合拉曼光谱清楚地表明,测试马伯展览不同的二级结构转换概要文件相比,模型的球状蛋白。马伯的芳香族侧链残留显示清晰的结构和构象变化与热应力和修改马伯的热稳定性低于马伯,此外,齐聚反应的机制似乎是引发的结构性变化在酪氨酸侧链和寡聚物形成的稳定,不分离的冷却。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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