动态光散射作为理解蛋白质的胶体稳定性的方法治疗

动态光散射(DLS)是一个著名的技术用于确定样本交互,示例多分散性和水动力直径biotherapeutic蛋白质在溶液中。拉曼光谱是另一种成熟的技术,获取蛋白质的二级和三级结构信息监控分子振动。

通过将这两种分析技术集成到单个乐器,一系列的物理、化学和结构参数可以确定。二级和三级结构的蛋白质,出现聚合温度、熔化温度、转变焓值、蛋白质溶解度、聚合的倾向,和潜在的高粘度浓度都可以派生制定。

获得的结果从拉曼光谱和DLS相同的样本可能会给独特见解展开和聚合的机制。本文描述了DLS可以用来理解蛋白质疗法的胶体稳定性。

方法和材料欧洲杯足球竞彩

Zetasizer螺旋(z螺旋)莫尔文Panalytical包含一个光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供拉曼(构象稳定性)和DLS(胶体稳定性)序列在一个样本。Zetasizer纳米系统包含专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术和电泳(ELS)静态(SLS)和动态光散射(DLS)来确定蛋白质的水力半径0.15 nm 5µm, 0.1毫克/毫升> 100毫克/毫升。

拉曼光谱收集使用785 nm励磁(~ 280 mW)从150年到1925厘米¹在一个4厘米¹决议。示例整除(~ 120 | L)然后引入一个3毫米石英试管和放置在一个舱提供温度控制在0°C到90°C±0.1°C。

执行后,热坡道研究通过收购DLS和拉曼数据在一系列预定义的0.1°C 5°C步进式增量。接下来,等温孵化研究由收集一组DLS和拉曼数据在一个预定义的时间间隔在一个首选的温度点。

结果与讨论

测量蛋白质在高浓度大小

图1所示。观察到的样本浓度增加对测量光散射强度。

近年来,制定单克隆抗体在生物制药行业的高浓度引起重大关注。然而,对于DLS,多个实验因素限制大小测量浓度制定。增加样品的浓度会影响观察到的散射强度大小,从而确定(图1)。影响测量的因素可能包括:

• 粘度
• 多次散射
• 积极/消极维里的影响
• Self-association

反褶积的效果帮助当口译高浓度样品的结果。

为了理解上述因素对DLS的影响数据,重要的是要考虑一个单独个体效应。表我显示了预测变化随着样品浓度的报道规模、相关函数、多分散性,还建立了校正技术,为每个不必要的因素。

表1。总结高浓度样品DLS参数的影响。

因素	明显的大小	明显的多分散性	相关路口	校正方法
多次散射	减少	增加	减少	反向散射
限制扩散	增加	没有变化	没有变化	粘度校正
- B22	增加	增加	没有变化	没有
积极的B22	减少	没有变化	没有变化	没有

图2。体积粘性的影响修正的尺寸测量结果。

粘度的影响修正的尺寸报告示例如图2所示。使用水的粘度粘度作为样本的估计导致增加悬浮粒子的表观尺寸(蓝色方块)。欧洲杯猜球平台

然而,当实际的本体溶液粘度的使用是为了适应DLS的结果,没有明显的尺寸变化是观察(绿色圆圈)。粒子交互条款包括排斥/有吸引力,k_D(扩散相互作用参数)或B₂₂(第二维里系数)表示。维里效果,没有证实技术可用来纠正DLS数据。

检测的蛋白质聚合

浊度或静态光散射(SLS)结合热增加迅速传统上用作配方筛选工具,用于蛋白质的稳定性。这些技术确定聚合温度T_发病。DLS方法也可以以这种方式使用。

图3。DLS热增加BSA(50毫克/毫升的pH值7.4)。

图3显示了聚合Z-averaged BSA发病约62°C的大小。此外,提供相关图仍然有效,DLS提供多分散性和尺寸分布(图3中,插入),而SLS只提供了强度。

在这里,大小分布趋势显示第二个峰值的出现在90 nm近60°C。多分散性的开始温度可能早在55°C,这意味着聚合可能更早开始。

图4。说明两个粒子的强度剖面5和50 nm直径。欧洲杯猜球平台强度比将1:1000000。

DLS的内在敏感性检测少量的骨料时是非常有用的。图4显示了两个粒子的混合物,直径有数量级的差异,更大的粒子(50 nm)将显示一个散欧洲杯猜球平台射强度的一百万倍,小粒子(5海里)。

这表明一个大型粒子结合众多导致同等强度被发现的微小粒子。欧洲杯猜球平台因此,DLS可能用作总出现最早的探测器。然而,解决DLS仅限于三倍大小。

预测胶体稳定性

尽管T_发病可能适合初始配方筛选,更好的理解蛋白质相互作用和蛋白质稳定性无法实现从这些实验。

最近,分子间参数被认为是预测蛋白质的聚合动力学,已与k_D和B₂₂。一个大型B的积极价值₂₂表示在self-association有利于溶质与溶剂,要么由于溶剂和溶质之间的良性互动或强烈的溶质分子之间的静电斥力。另一方面,大负的B₂₂显示强大的self-attractive系统,有利于粒子的聚合或self-association完全溶解。欧洲杯猜球平台

对于DLS, k_D可以直接计算它与B₂₂由以下方程:

在这里,维指的是扩散系数的计算DLS,C是样品浓度和D₀自扩散系数。k_f是第一个订单集中的摩擦系数,M_w是样品分子量和v是溶质的部分具体体积。

下面的实验表明,k_D可以应用于预测蛋白质的稳定性四个配方中免疫球蛋白。在图5中,可以看到,只有汤2(红圈)有一个积极的k_D,这意味着一个强大的排斥相互作用的蛋白质样品,其他三个样本显示略- k_D。大积极k_D通常表明积极的B₂₂或强烈的排斥作用。然而,当k_D是接近于零,很难直接链接到B₂₂。

图5。k_D情节测量四个配方中免疫球蛋白的解决方案。

SLS可以确定在一个固定的角度₂₂,电动电势能提供相对确定电荷(表2)。使用的所有信息,一个完整的蛋白质特性可以实现预测蛋白质的稳定性。例如,我们预测,制定1是最不稳定的免疫球蛋白,同时制定2是最稳定的。

表2。免疫球蛋白的总结预测参数的稳定性。

免疫球蛋白制剂	B22(105毫升摩尔/ g2)	kD(ml / g)	负责
汤1	-1.5	-5.2	3.3
汤2	127.5	31.9	9.7
汤3	10.4	-9.7	5.1
汤4	2.3	-4.7	-2.8

图6。DLS热一个免疫球蛋白样例的增加在四个不同的配方。

支持这一预测,热增加实验进行相同的样本集(图6)。令人惊讶的是,样本1 T最低_发病,而配方2是最稳定的,表示没有证据表明大总量达到90°C。

结论

拉曼光谱和DLS的集成到一个单独的仪器提供了独特的分析功能,可以用来确定融化温度,二级和三级结构的蛋白质,和相同的样本大小和发生聚合,在不改变测试条件。结合nib技术时,DLS提供了一个独特的方式获得粒子相互作用参数(B₂₂),体积粘性和有限扩散相互作用参数(k_D),出现聚合温度、熔化温度和过渡高浓度配方的焓变。

未来的研究将提供一个洞察独家相关性可能来自拉曼光谱和DLS为了改善机制的理解,聚合的动力学和热力学。

这些信息已经采购,审核并改编自莫尔文Panalytical提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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