拉曼光谱和动态光散射(DLS)的结合提供了关于低浓度和高浓度蛋白质的物理、化学和结构参数的重要信息。用于确定蛋白质构象的拉曼光谱(Raman)和用于研究蛋白质大小的DLS光谱(DLS)被集成到一个系统中，在类似条件下监测应激蛋白样品。
拉曼光谱适用于从高浓度的蛋白质样品中提取二级和三级结构标记，而DLS则适用于确定低浓度蛋白质的大小。这些综合分析技术可以用来研究蛋白质的最低浓度。
由于DLS非常适合于分析低浓度样品，本文描述了采集拉曼光谱的最低蛋白浓度限制，并探讨了DLS/拉曼仪器研究不同浓度的蛋白样品的能力。由于分析技术有不同的浓度，有必要建立蛋白质样品的实际浓度下限和上限。
方法和材料欧洲杯足球竞彩
来自Malvern Panalytical的Zetasizer Helix（ZS螺旋）将纤维耦合拉曼光谱仪与Zetasizer Nano ZsP相结合，以在单个样品上依次提供拉曼（构象稳定性）和DLS（胶体稳定性）数据。
这Zetasizer Nano system combines non-invasive backscatter (NIBS) detector technology with electrophoretic (ELS), static (SLS) and dynamic (DLS) light scattering in order to determine the proteins’ hydrodynamic radius from 0.15 nm to 5 µm, from 0.1 mg/mL to > 100 mg/mL.
使用150厘米的785 nm励磁（〜280 mw）－1- 1925厘米－1在4厘米－1收集Raman Spectra的分辨率。然后将样品等分试样（〜120μl）引入3mm石英比比色皿中，并置于隔室中，将温度控制从0℃至90℃±0.1℃。
然后，通过在预定义的0.1°C - 5°C的步进增量范围内收集DLS和拉曼数据，进行热斜坡研究。等温培养研究也通过收集一组DLS和拉曼数据在一个预先定义的时间间隔在一个首选的温度点进行。
对低浓度蛋白质样品的拉曼光谱数据采集条件进行了优化，以确定获得蛋白质治疗学拉曼光谱的实际检测限。两种样品，单抗和溶菌酶，在不同浓度下进行分析。
二级结构标记，如酰胺I (1600cm－1- 1700厘米－1)和酰胺III(1200厘米－1- 1350厘米－1)，三级结构-1 -1标记，如~830 cm处的酪氨酸－1和色氨酸在约1550厘米处－1在热斜坡实验中观察到。这些标记的修饰表明在加热过程中蛋白质结构发生了变化。这提供了检测任何变化的能力，这在分析蛋白质结构时很重要。
结果与讨论
本文侧重于确定使用组合DLS /拉曼仪器研究蛋白质的最低浓度限制。由于DLS适用于较低浓度样本，因此大多数努力在优化拉曼采集参数时进行。为了增加来自具有较少拉曼散射颗粒的较低浓度样本的拉曼信号，增加积分时间是实际的，并且还增加多次扫描的共同增加的数量。欧洲杯猜球平台
为了保证实验时间的实用性，对于mAb和溶菌酶浓度的样品，所有采集时间都维持在或低于30分钟。使用浓度较高的样品，以建立蛋白质结构的预测变化。表1显示了获取单克隆抗体和溶菌酶数据时所使用的采集参数的总结。
表1。单温下溶菌酶和单抗样品的数据采集参数。
| 样本 |
积分时间(s) |
共增加（＃） |
拉曼采集时间(s)/T |
总采集时间(min)/T |
| 35毫克/毫升溶菌酶 |
15. |
10. |
150. |
5．5 |
| 12 mg / ml溶菌酶 |
30. |
10. |
300 |
8. |
| 3 mg / ml溶菌酶 |
40 |
40 |
1600 |
30. |
| 50毫克/毫升马伯 |
20. |
10. |
200 |
6. |
| 10毫克/毫升马伯 |
20. |
10. |
200 |
6. |
| 5毫克/毫升马伯 |
25. |
40 |
1000 |
20. |
溶菌酶
对3mg/mL、12mg/mL和35mg/mL溶菌酶样品在pH为4的柠檬酸缓冲液中进行热裂解实验。用最高浓度的样品作为与低浓度样品比较的参考点。
35mg/mL溶菌酶溶液在25°C(用淡红色痕迹表示)和90°C(用暗红色痕迹表示)下的光谱包括在内(图1A)。特定的蛋白质标记被突出显示，代表在温度斜坡实验时二级和三级结构的变化。a-螺旋骨(930 cm)变化明显－1- 950厘米－1），酰胺I（〜1600厘米－1- 1700厘米－1），酰胺III（〜1200厘米－1- 1350厘米－1)和色氨酸在760厘米处－1．
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图1。35mg / ml溶菌酶光谱在25℃（红线）和90℃（暗线）（a），在相同温度（b）处的尺寸数据，以及用温度（c）的酰胺峰值偏移。
高浓度溶菌酶样品也考虑DLS大小数据(图1B)。正如预期的那样，随着温度的升高，溶菌酶的大小也会增大。这说明随着温度的升高，蛋白质的展开(也可能是聚集)正在发生，这与光谱数据显示的蛋白质结构随着温度的升高而发生变化相一致。
此外，还包括了酰胺I峰的质心(COM)随温度的位移，如图1C所示。随着温度的升高，COM向更高的波数移动，这意味着随着温度的升高，结构从a-螺旋向P-sheet丰富的转变。在这个高浓度下，拉曼数据可以用于蛋白质检测和表征，并可以获得跃迁数据。这个信息被用作较低浓度数据的比较。
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图2。从pH 4柠檬酸盐缓冲溶液中3mg / ml，12mg / ml和35mg / ml溶菌酶的结构和尺寸数据。
DLS强度分布，拉曼光谱和低（3mg / ml），培养基（12mg / ml）和高（35mg / ml）溶菌酶浓度的换算，如图2所示。从3mg / ml浓度的拉曼数据溶菌酶样品（由蓝线表示）是最嘈杂的，而35mg / ml（由红线代表）的拉曼光谱是最嘈杂的，并且12mg / ml样品（由黑线代表）在中间落下这两（图2a）。
DLS数据的强度分布表明，在25°C时，溶液中的蛋白质分子均为~4nm(图2B)。三种浓度的光谱数据和尺寸数据在起始温度下的相似性表明DLS/Raman组合可以用于低至3mg/mL浓度的溶菌酶检测。酰胺I峰的COM位移包括了所有浓度(图2C)。
通过PLS模型进行低浓度和高浓度样品之间的进一步比较，以确定五种浓度的溶菌酶的二次结构组成（图3）。
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图3。二级结构PLS模型用于确定25°C下不同溶菌酶浓度样品的α螺旋、β薄片、β旋和随机线圈组成(30°C下报告12 mg/mL值)。
对于每个溶菌酶样品，预测了四种不同的二级结构组成，如α螺旋、β旋转、β薄片和随机线圈。alpha螺旋所占比例最高，平均为44.0%±2.0%。这个值与文献报道的pH值接近4的溶菌酶溶液一致。
虽然在不同浓度之间可以看到微小的差异，但在不同浓度之间的值是相似的，再次表明从低浓度的样品中获得的拉曼数据是溶菌酶的一个很好的代表。
单克隆抗体
与溶菌酶相似，用DLS/Raman技术分析低浓度(5mg/mL)、中浓度(10mg/mL)和高浓度(50mg/mL)的单抗样品。然后在25°C到90°C之间进行热爬坡实验，所有浓度的步骤为0.2°C到0.5°C。
对于高浓度样品，拉曼光谱采集时间为3.3分钟/温。这种采集时间使得拉曼光谱具有较高的信噪比。图3显示了30℃和80℃下的拉曼光谱。通过分析，可以清楚地看到，当蛋白质溶液在热应力下时，会发生三级结构变化。
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图4。高浓度单抗的光谱(50mg/mL数据)。热转变不如溶菌酶样品明显(图1);但在高浓度时，次生和三级结构标志的变化是明显的。
图4显示了单抗5mg/mL(蓝色)、10mg/mL(黑线)和50mg/mL(红线)样品在25℃下的光谱。来自最高浓度和最低浓度样品的数据分别产生最小和最大的噪声谱。
基于不同浓度的MAB样品中获取的数据，低至5mg / ml的浓度可用于样品检测。然而，为了阐明热转变，浓度必须高达10mg / ml。
结论
这互补技术的组合，DLS /拉曼，可以有效地用于描述当暴露于压力源时的蛋白质尺寸（DLS）和构象（拉曼）变化。通过进行热斜坡实验评估了拉曼检测的较低浓度限制。可以分析浓度为3mg / ml的溶菌酶，以及鉴定二次和叔结构标志物。
另一方面，单克隆抗体可能只有三级结构变化。因此，DLS和拉曼光谱的结合可以为蛋白质在高浓度和低浓度下的展开和聚集途径提供独特的见解。
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此信息已被采购，从Malvern analytical提供的材料进行审核和调整。欧洲杯足球竞彩
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