写的AZoM2014年9月1
由着名的法国化学家Louis Pasteur进行的研究表明，从葡萄糖中生产酒精与酵母直接相关。该微生物的发酵特性用于乙醇，葡萄酒，啤酒，食品和生物燃料制造。因此，可靠的酵母性能在发酵过程中很重要。为了最佳酵母性能，需要监测百分比细胞浓度和活力。Beckman Coulter的VI-Cell™XR Cell活性分析仪自动化手动台盼蓝染料排除方法。
这篇文章描述了贝克曼库尔特研究酵母细胞活力的最佳实践。这次分析中使用的仪器是VI-Cell™XR试剂包。
Vi-CELL™XR软件
VI-Cell™XR软件具有许多细胞类型，这些细胞类型是存储所需光学设置的文件，以准确地识别和测量不可变细胞的可行细胞。酵母细胞具有高细胞浓度并表现出大尺寸的分布。
它们不能轻易染色，并且可能包括来自发酵过程的大量碎屑。结果，酵母细胞可能难以计数。为了达到精确的细胞浓度和活力结果，有必要改善酵母的细胞类型。
样品制备
首先，用50µm的筛子过滤酵母发酵样品。这有助于清除大量的碎片(如果有的话)。然后使用首选的缓冲液或生长培养基对样品进行稀释，使其浓度介于5 × 104至1 × 107细胞/mL之间。在运行在Vi-CELL™XR分析仪之前，一个Multisizer系列或Z系列COULTER计数器可以用来检查细胞的浓度。
仪器设置
接下来，酵母样品在Vi-CELL™XR仪器上通过默认的酵母细胞类型进行检测。结果表明，酵母样品中存在发酵过程中积累的淀粉粒，且细胞染色不全。通过对酵母细胞类型做一些小的改变，纠正了这一点。修改如表1所示。
表1。单元格类型参数优化。
| 单元格类型参数 |
默认值 |
优化的价值 |
修改的原因 |
| 最小直径 |
3. |
2 |
减少尺寸范围以确保所有酵母细胞计数。 |
| 最大直径 |
20. |
11 |
减少最大尺寸范围，以便排除非酵母细胞（碎片）。 |
| 吸入周期 |
1 |
3. |
增加吸气循环以确保酵母细胞不粘在样品杯上。 |
| 台盼蓝混合循环 |
3. |
9 |
增加台盼蓝混合循环以增加染色时间。 |
| 细胞的亮度 |
85 |
90. |
增加细胞亮度到最大值90，因为酵母细胞在图像中非常明亮。 |
| 最小循环 |
0 |
0.65 |
最小圆度只适用于不能存活的细胞。增加该值将排除与不可活细胞大小相似的碎片。 |
| Decluster程度 |
高 |
低的 |
我们样品中的酵母细胞分开很好，因此对该分析适合降低低的降低程度。 |
分析
从2h、18h、26h三个不同的时间间隔提取酵母菌发酵样品。然后将所有样品稀释500倍。随后，通过新的优化酵母细胞类型，在Vi-CELL™XR系统上连续运行每个时间间隔的5个副本。表3显示了基于从使用这些酵母菌株的生物过程工程师那里获得的反馈的预测结果。
结果
表2。结果:每个样品N=5个重复;稀释系数= 500。
| 酵母样例ID |
发酵时间 |
总细胞计数浓度(1 × 106细胞/毫升) |
总细胞计数% CV |
%可行性 |
活力浓度% CV |
| 1 |
26小时 |
1133年 |
2％ |
68％ |
1% |
| 2 |
18个小时 |
1146年 |
2％ |
74% |
2％ |
| 3. |
2小时 |
787. |
2％ |
72% |
2％ |
表3。预测的结果。
| 酵母样例ID |
预测的结果 |
证明了吗? |
| 1 |
样品1比样品2的存活率低% |
是的 |
| 2 |
样品2比样品1有更高的%生存能力 |
是的 |
| 3. |
样品3的细胞总数低于样品1和2 |
是的 |
表2和3总结了从中获得的结果VI-Cell™XR运行。酵母发酵样品的细胞浓度和存活率均达到了预测结果。此外，该系统还报告了细胞圆度、活细胞浓度、大小分布和平均直径。
酵母分析：VI-Cell™XR对手动台盼蓝可活力测试
如上所述，台盼蓝染料排除方法是用于确定细胞活力的标准技术。等体积的细胞与台盼蓝染色（0.4％）组合。由于活细胞具有完整的膜，它们排除了台盼蓝色染色，而非活力细胞具有渗透膜并染色深蓝色。
手工方法使用显微镜和血球计，需要技术人员确定未染色和染色，也需要手工确定存活率。该方法不仅劳动密集，而且由于其主观性，精度误差较大。
工业生物开发实验室(IBDL)对细胞计数的人工方法和自动方法(即台班蓝染料排除法)进行了评估，发现不同的人使用血球计确定的细胞计数有相当大的差异。这种差异可归因于样品制备的不一致，或对单个细胞的生存能力和非生存能力的决定。
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图1所示。酵母活力染色比较。图片来源:贝克曼·库尔特
VI-Cell™系统确定通过实验过程中整体再现的细胞活性和浓度。它们还靠近个体细胞的平均值，并且没有经历人类计数的广泛差异。这表明VI-Cell™仪器是用于细胞计数的可再现，精确和合适的工具。已被证明耳蛋白蓝色重要染料等于酵母细胞的亚甲基紫和亚甲基蓝（图1）。
结论
Vi-CELL™XR细胞活力分析仪自动化的酵母菌活力测量在发酵过程中使用的手工技术。该仪器不仅消除了人工检测的主观性质，而且为每个检测提供了公正的结果。通过改进酵母细胞类型，非细胞对象从结果中删除，只针对感兴趣的细胞。
该仪器结合了专有算法、先进的成像技术和流体管理，是全自动的，能够进行试剂处理、样品吸入和随后的清洗。与手动技术相比，v - cell™XR能够分析多达100张图像，整体体积从15倍增加到30倍。结果在2.5分钟内获得，可以打印存档或发送到Excel文档。
该信息来源于Beckman Coulter, Inc. -粒子表征公司提供的材料，并经审查和改编。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问贝克曼库尔特公司-颗粒尺寸表征．