利用SEC多检测器分析膜蛋白

排阻色谱(SEC)是生物科学领域常用的一种色谱技术。欧洲杯线上买球

这种方法通常是通过将未知分子量的洗脱时间与已知分子量的标准相比较来确定样品的分子量。该过程使用浓度检测器，如折射率(RI)或紫外线(UV)来执行。

现在，复杂的多探测器SEC解决方案有多达四个探测器，如RI, UV，固有粘度(LV)和光散射(LS)。在本文中，细菌膜蛋白和纯化的膜蛋白样品通过vistek TDAmax系统(图1)进行了表征，该系统是一个综合的SEC系统，具有UV、RI、LS和IV检测器。

图1所示。TDAmax系统。

光散射和特性粘性

特性粘度被定义为分子密度的量度，有助于评估结构变化。

光散射检测器有助于确定分子量和柱校准的必要性。特性黏度和光散射使尺寸测量成为可能(R_h）．重要的是要保持检测器，以便在所有四个检测器中保持高水平的灵敏度。

在分子生物学研究中，膜蛋白的研究越来越多。这些研究的关键目标之一是蛋白质的结晶。然而，这个过程已经被证明是非常复杂的，因为膜蛋白的结晶依赖于许多因素，如蛋白质的纯度和洗涤剂的类型或浓度。当过量的蛋白质复合物的洗涤剂成分被去除时，它可以降解蛋白质，从而降低结晶的可能性。

因此，对膜蛋白纯化样品中洗涤剂和蛋白质的用量进行表征和优化，可以更好地了解结晶的可能性以及蛋白质洗涤剂复合物(PDC)中蛋白质的含量。

实验框架

样品纯化使用n-十二烷基ß- d -麦芽糖(DDM)洗涤剂。以添加0.02% w/v DDM的PBS为流动相，在GE Superdex 200 SEC色谱柱上分离。

采用OmniSEC共聚合物分析，利用洗涤剂和蛋白质的dA/dc和dn/dc来确定色谱图上每个数据切片上两个组分的浓度和分子量。该蛋白的dn/dc值为0.185ml/g，其消光系数预测为0.5 (A280;1毫克/毫升)。既往研究表明，DDM的dn/dc值为0.1608ml/g，其消光系数计算为0.0044 (A280;1毫克/毫升)。

结果与讨论

考虑到只有少量纯化蛋白可用于检测，本文采用牛血清白蛋白(BSA)研究了蛋白质和洗涤剂在体系上的胶束行为。利用蛋白质的分子量来校准仪器的检测器响应。然后，对剩余的纯DDM胶束进行运行，以确定其大小和分子量。DDM、BSA及两者的色谱图如图2所示。

图2。从上到下，是BSA, DDM和两者混合物的色谱图。

从上图中可以看出，两个样品在不同的体积洗脱，两者之间的分辨率是合理的。此外，DDM的信号非常低，而BSA在UV通道(280nm)上显示相当大的吸收。这一点从色谱图上可以明显看出，当两个样本一起运行和单独运行时。

计算BSA的分子量为67kDa。单独测定时，DDM胶束的尺寸为2.5nm，定量分子量为60kDa。当同时测量DDM和BSA时，DDM的分子量(65kDa)略有增加。这可能是由于两个峰值之间的分辨率受到限制。

当DDM和牛血清白蛋白在体系上运行正常后，注入膜蛋白。蛋白浓度0.5mg/ml，负载100µl。在一个峰中，样品根据RI的上升边缘用肩洗脱。该肩峰与大部分的UV信号有关，可区分为蛋白洗涤剂复合物(PDC)，而峰的主体有少量的UV信号，表明这是DDM胶束，如图3所示。

图3。细菌多药膜蛋白色谱图。

无紫外吸收峰的区域大小为2.6nm，测量的分子量为62.5kDa，因此可将其区分为DDM胶束。紫外峰和肩峰被认为是PDC，分子量为74.5kDa。通过对共轭物的检测，整个样品中PDC的含量为21.6%，而DDM胶束的含量为78.4%。PDC由54%的DDM和46%的蛋白质组成。该蛋白的分子量为33kDa，接近蛋白含46% PDC的估计，为所得结果提供了很好的验证。

对于这两种成分中的每一种，浓度都可以测量，并绘制在派生的色谱图中，显示该成分的浓度，而不是检测器的响应(图4)。

图4。导出的色谱图显示蛋白质的浓度(紫色)和DDM(蓝色)。测得的分子量在两个峰之间标绘出来。

这样可以很好地直观地表示样本的组成。在这种情况下，很明显，与DDM胶束相比，蛋白质的浓度要低得多。此外，很明显，大多数DDM不在PDC中，而是在自由胶束中。在导出的色谱图上，还绘制了两个峰的分子量。

结论

使用Viscotek TDAmax系统，对在DDM存在下纯化细菌多药膜蛋白时出现的蛋白洗涤复合物进行了表征。测定了游离DDM胶束和PDC的分子量。此外，测定了PDC的组成与DDM和蛋白质含量的关系，并观察到与预期接近。

这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．