在与蛋白质结合过程中表征流体动力学变化

在许多生物信号传导途径中，小而高电荷的阳离子促进蛋白质结合后的结构变化。了解这些结构变化对于更好地了解这些信号通路的调控非常重要。

虽然由阳离子结合控制的信号级联有很大的不同，但不同蛋白质之间通常保留着独立的阳离子结合基序毒素重复序列（Repeat-in-Toxin，RTX）是病原微生物释放的一类阳离子结合基序，存在于多种毒力因子上。富含天冬氨酸和甘氨酸的结构域是RTX的序列，包含一种特殊类型的钙²⁺结合位点。

这个结合位点对分泌毒素的功能至关重要，包括腺苷酸环化酶毒素（CyaA）。CyaA毒素具有在溶液中结合钙的能力。为了促进这些毒素分泌到细胞外空间，可以利用它们的钙依赖性。这是因为新产生的肽必须穿过分泌机制的狭窄通道。

当细菌胞浆内钙浓度较低时，RTX基序呈未折叠构象，为分泌创造了有利条件。但是，一旦进入细胞外培养基，RTX结构域会由于较高的钙浓度而附着在钙离子上并形成结构蛋白。因此，为了区分RTX功能的机制，我们使用了许多生物物理技术来检测CyaA的RTX重复结构域（RD）在钙结合后的大小和构象变化。

用SEC-TD测量分子质量和特性粘度

制备蛋白质和材料后，使用GE Heal欧洲杯足球竞彩thcare的Superdex 200色谱柱进行尺寸排阻色谱（SEC）实验。由GPCmax模块控制，Superdex 200列与Malvern Panalytical的302三重探测器阵列（TDA）在线连接。

TDA包括以下组件：

• 差动粘度计
• 光度计
• 差分折射率探测器
• 装有两个光电二极管探测器的静态光散射池，直角光散射为90°，低角光散射为7°

使用折射率检测器和光度计来确定蛋白质的浓度。通过LALS和RALS数据以及浓度获得分子量的M'。使用差分粘度计，测定内在粘度（η）并使用OMNISEC软件确定固有粘度和分子量。

利用Malvern-Panalytical公司的Zetasizer纳米ZS仪器进行电泳迁移率和zeta电位实验。该仪器以17°角监测前向光散射。采集前，在0.2µm大小的过滤器上过滤样品和缓冲液。RTX多肽的浓度在70至130µM之间变化，并在20mM NaCl、pH 7.4和20mM Hepes中稀释。利用快速场反转模式，利用微紫外ZEN1010和比色杯DTS1070获得电泳迁移率值。在这种模式下，每个样品获得5到10个独立的测量值。

为了维持测量，质量标准基于以下参数：

• 相位图的质量（频率和弧度幅度）
• Zeta品质因素
• 在整个数据采集期间不应改变的平均计数率
• 相位图的傅里叶变换

平均与令人满意的电泳迁移率相关的测量值，并计算典型的偏差。由此获得的数据被利用以产生每个状态的电泳迁移率的分布_S和rc._L.

核磁共振波谱（NMR）、圆二色谱（CD）和分析超速离心（AUC）是本研究中使用的其他技术。

结果与讨论

在钙结合后的重复结构域（RD）的生物物理性质和蛋白质构象中观察到变化，其被彻底检查。具体地，SEC和TDA的组合揭示了关于肽行为的关键数据。这些数据如下所示。

通过钙与RD结合诱导的有序结构的形成

从NMR和远紫外CD方法获得的数据表明RD-sans-钙以无序状态存在，而RD与钙结合即Holo-RD形成独特的二级结构。

为了进一步研究这些变异，SEC结合TDA用于Holo-和Apo-RD，其中Apo-RD在10.4mL的保留体积（RV）下洗脱，这与约600kDa的折叠蛋白质一致。然而，Holo-RD在13.8mL的RV下洗脱，这与适当大小的球状蛋白的预测RV接近（图1A和B）。

图1。A.apo-RD和holo-RD.B的紫外吸收（平曲线）和偏转折射计（点曲线）色谱图。apo-RD和holo-RD的直角光散射（平曲线）和压差色谱（点曲线）。

另一方面，从直角光散射强度获得的数据表明分子量没有改变，表明RV的变化不归因于蛋白质的低聚（图1B）。另外，差分粘度计峰的尺寸在两个状态之间具有大量不同，并且产生的特性粘度值（η）为35.1ml.g^-1和5.5mL.g^-1分别为Apo RD和Holo RD。鉴于RV与流体动力容积有关，载脂蛋白RD的高值说明RV较低。

利用AUC方法进一步研究证实，Apo-RD和Holo-RD具有不同的沉降系数，但分子量相同，为73kDa。这些数据还揭示了水动力半径（R_H)Apo-RD和Holo-RD分别为6.5nm和3.2nm，表明在钙结合之后，RD从无序的肽结构转变为具有有序二级结构的紧密形成的肽。

钙诱导结构变化所需的区域的特征

这个Cyaa的Rd.包含大约40个RTX图案，其被布置成五个连续块，每个块由C端子和N末端侧翼区域分开。制备一系列肽构建体（图2），以表征这些侧翼区域如何有助于依赖钙依赖性结构变化。

图2

从色氨酸荧光和CD获得的数据表明，钙的存在没有改变结构域R和NR的结构。包含C末端侧翼区域的所有构造在加入钙之后获得了二次结构。因此，n末端涉及N-终端，而C末端区域需要形成由钙诱导的二次结构。

为了进一步研究钙诱导的变化，用SEC-TD法比较钙不敏感（R）和钙敏感（RC）_L)肽（图3）。钙结合后，RC_L显示特性粘度和RV的变化（图3A，C），这表明R_H. 另一方面，从RALS和差示折射计获得的数据表明，两者的分子量保持不变，并且与单体的形式一致。

与RC相反_L域，R域显示所有测量参数的钙依赖性（图3B，D），包括RAL、RV、压差信号和屈光度差信号。

图3

因此，添加钙并未产生r的任何显着变化_HR结构域内的固有粘度或分子量。这支持C末端侧翼区域在钙引起的畴结构变化中起关键作用的结论。

钙诱导的低聚物形成

AUC法测得的数据表明，R_H在钙结合之后没有变化，而CD光谱法的数据检测到Holo-RC之间的光谱变化_S和载脂蛋白RCS。为了理解这些模糊性，对RC进行了SEC-TD分析_S领域。与RC相反_L（图3A，C），钢筋混凝土_S在钙结合后在RV中保持不变，表明Holo-RC_S和apo-rc_S表现相似流体动力学体积，如图4所示。

图4

差示折射计和RALS的数据表明Apo-RC_S和全息RC_S分子量为15.1kDa，类似于单体，分子量为42kDa，类似于三聚体的形成。特性粘度由14.7降至6.4mL.g^-1钙结合后。所有这些数据都表明RC形成了致密的三聚体_S钙结合后。

结论

为了理解信号通路的调控，了解阳离子结合引起的结构变化是非常重要的。以上数据显示了如何利用不同类型的生物物理技术来区分钙结合后蛋白质大小、电荷和构象的变化。

特别是，SEC-TD的应用有助于解释整个研究过程中使用的肽的特性粘度、大小和分子量。这些数据不仅有助于识别钙结合促进的变化，而且有助于识别诱导这些变化所需的基序和结构域。此外，zeta电位测量的应用有助于理解肽和带电离子之间的相互作用。

本信息来源、审查和改编自Malvern Panalytical提供的材料。欧洲杯足球竞彩

有关此来源的更多信息，请访问马尔文泛分析.