用ITC求酶动力学常数

酶作为一种生物催化剂，在活生物体内发生的几乎所有过程中都起着重要作用。单独研究系统中发生的酶反应对于深入了解任何生化现象至关重要，目的是了解酶对底物的识别过程及其作为产物形成催化剂的方法。了解酶与天然底物结合和加工的机制是开发下一代抑制剂的必要条件。

在获得酶和底物后，需要发展一种分析技术来研究酶催化反应。这些数据和结构研究数据的结合提供了对酶机制的见解。这些知识有助于使用合理的方法开发潜在的抑制剂。然而，开发合适的分析方法是一个具有挑战性的过程。

解决方案-高灵敏度ITC

高灵敏度ITC这是一种经过验证且稳健的技术，可以通过定量观察酶反应来获得描述系统的相关米氏动力学常数，从而应对这一挑战。作为一种多功能的仪器，ITC越来越多地用于定量平衡缔合反应的热力学。

ITC提供结合焓（ΔH）的测量值_B)直接和不使用模型的可逆相互作用的变化。此外，平衡缔合常数（K_A.)对于酶-底物复合物，可以使用精心设计的实验进行粗略计算，其中限制步骤是产物形成和反应的化学计量比（n）。因此，在ITC的帮助下，几乎可以获得任何双分子络合物形成的完整热力学曲线。

ITC是一种广泛使用的分析任何酶催化反应的分析技术，只要热信号与反应有关。完成实验所需的时间更少（通常约2小时），并且消耗的材料更少。本文探讨了ITC在催化反应分析中的应用，并展示了ITC衍生酶反应数据的分析方法，以确定酶动力学参数。

量热法与动力学

由于反应过程中释放的热能是一个可测量的事件，因此可以用ITC测量酶动力学参数。反应速率与热功率成比例变化，热功率表示为时间（dt）的函数：功率=dQ/dt。MicroCal VP-ITC的最小响应时间为15s，并且可以非常快地研究许多过程的酶反应速率，从而避免了对量热计时间常数的可测量热功率进行校正的需要。

ITC的正常滴定模式允许多次注入底物，从而能够在稳态条件下在单个实验中确定多个速率。此外，现代ITC仪器非常灵敏，需要的酶量与分光光度测定法相似，但比放射性测定法更高。n摩尔基质转化为产物时产生的热量表示如下：

式中，ΔH_应用程序=实验确定的反应总摩尔焓；P=产生的产品浓度；V=反应溶液的体积（电池体积）。

热功率表示如下：

通过将上述方程式重新排列如下，可获得反应速率：

反应速率方程表明，有必要使用量热计测定总摩尔焓和产生的功率（dQ/dt），以获得米氏图。使用量热法分析酶催化反应同时提供基于米氏动力学和热力学数据。

ITC分析

ITC是一种简单但可靠的分析仪器，允许操纵上述所有实验条件，以经济且无需标记的方式对酶系统进行系统表征。在合适且定义明确的缓冲系统中配制反应物对于所有ITC实验至关重要。需要准确测量底物和酶的摩尔浓度，以使用ITC进行ITC酶分析。测定表观摩尔焓对于ITC分析至关重要。测定活性酶的准确摩尔浓度也是有利的。还需要准确量化溶液中的底物浓度。

为了进行ITC分析，有必要进行两种类型的实验。第一个实验是测定总摩尔焓，方法是将细胞中相对大量的酶和底物以相当低的量保留在注射注射器中，以便在注射之间提供足够的空间，以便将所有底物转化为产物。ΔH_应用程序可使用合成峰以正常方式获得。

第二个实验是通过在细胞中保持相当低浓度的酶，在注射注射器中保持相对较高浓度的底物，以在注射之间提供较小的间隙来确定反应速率数据。目的是保持稳态条件，并确保不超过5%的底物被释放根据这两个数据集，米氏定义了酶参数K_MK_猫及V_最大值可以导出。

示例

本例显示了丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PP1-γ，见图1）的酶速率数据。ITC被用来分析这个系统。使用图1所示的酶和PNPP作为底物，进行上述两种类型的ITC分析。有助于确定该酶催化反应速率数据的分析结果如图2所示。

图1。PP1催化亚基的X射线晶体结构（来自参考文献14）；显示了活性位点His、Asn和Asp残基。（B）PP1的活性位点显示了双核八面体配位金属离子核和桥接无机磷酸盐（产物）。

图2。测量PP1-γ水解PNPP反应速率的原始量热数据。虚线是最适合预注射基线的线性最小二乘法。

微软™ 擅长™ 电子表格最初用于分析图2所示的结果。Origin中的非线性最小二乘分析软件包™ 使用5.0拟合速率数据。根据这些数据，ΔH_应用程序PPI-γ-PNPP系统的分析结果如图3所示。基板稀释热在上面板中以绿色表示。

图3。在顶部面板中，红色峰是用于测定ΔH的原始量热数据_应用程序用于PP1-γ水解PNPP。这些峰的积分给出了下面板中的数据。

该分析的主要目的是验证ITC在该酶系统动力学分析中的应用，并将ITC衍生的酶参数与从其他分析中获得的值进行比较。由于这个原因，PNPP被选为模型底物，它已经有一个完善的光谱分析。通过以类似于ITC分析的方式进行光谱分析来评估量热数据。

光谱分析用于推导许多不同底物浓度下的初始速度，以建立Michaelis-Menten图。图4显示了综合ITC和光谱数据。给出了两组酶浓度标准化的数据。第一个是ITC分析的速率数据（以蓝线表示），第二个是分光光度法分析的类似数据（以红线表示）。蓝线表示最佳拟合光谱数据的非线性最小二乘法，使用以下方程式拟合：

图4。PP1-γ水解PNPP的速率与底物浓度数据。

结论

结果清楚地证明了使用ITC定量酶动力学的优势。对于给定的系统，ITC分析数据与正常光谱分析数据具有良好的相关性，表明ITC优于其他方法。除了提供优质的酶速率数据外，量热法还测量反应的热力学。ITC分析的这一特征有可能提供有关酶催化反应的高质量和广泛的数据。

本信息来源、审查和改编自Malvern Panalytical提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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