使用微量孔Q-ITC仪器来满足药物发现的需求

低分子量（LMW）配体和蛋白质之间的相互作用的表征和测量对于药物发现至关重要。结合相互作用表征期间面临的最常见问题之一是需要评估广泛的结合亲和力（K_D)，并根据作用机理、亲和和相互作用能学对LMW配体进行精确分类和区分。

然而，非活性蛋白的存在或蛋白浓度的错误评估使得结合数据很难得到可靠的解释。这种信息的评估由于复合股票集中的不确定性而进一步复杂化。

等温滴定热量仪

等温滴定热量测定法，也称为ITC，可以直接确定在结合过程中吸收或释放的热量。它可以在溶液中研究蛋白质和小分子之间的相互作用，并消除对固定或标记的需要。

结合高灵敏度ITC系统和优化的实验条件，可以帮助证明不准确评估的非活性蛋白组分、蛋白浓度和复合溶液浓度。因此，ITC提供了对生化数据的更好的理解，从QC和分析开发到先导优化。

本文展示了新ITC仪器的好处：MicroCal PEAQ-ITC和微量ITC自动化系统，以及微量PEAQ-ITC分析软件。

改进了SAR

活性蛋白质浓度测定

ITC通过药物发现的初始阶段使用，对涉及铅优化的最终阶段。它也可以用于蛋白质纯化QC步骤以评估批量差异和冻融稳定性。

阳性对照配体的间歇使用使得可以监测蛋白质的质量并在一组ITC实验中验证活性蛋白质浓度。

MicroCal PEAQ-ITC分析软件能够为一系列连续的滴定创建结合参数的散点图。这样的图可以确定可能的趋势以及与分析设置和试剂质量有关的潜在问题。

图1所示。将微量PAP-ITC软件产生的N值散射曲线图，用于磷酸盐缓冲盐水（PBS），25℃下的50pM牛碳酸酐酸盐II（BCAII）的一系列连续滴定。实验在微量ITC自动化系统中进行。

图1显示了一组连续ITC滴定获得的N值的散点图，显示了靶蛋白上结合位点的表观数量趋势。N值随时间的稳定下降很可能反映了靶蛋白的稳定性问题。与蛋白质-配体相互作用分析相关的常见问题是批与批之间的变异、有限的蛋白质稳定性和靶蛋白有限的冻融稳定性。

ITC数据对于确定一种相对于早期批次的表观活动（结合）中的一批蛋白质是否不同是重要的，并且提供可能的归一化标准，其在筛选和表征过程中运行许多测定中的助手。

具有在ITC数据研究中使用的活性蛋白质浓度，可以分配表观化学计量中的任何残留误差以不准确的浓度测定配体。

精确的配体浓度测定

在药物发现中，化合物溶液的浓度具有相当大的误差，其直接影响通过配合结合信息返回的结合参数的质量，特别是在准确测定与结合的熵和焓贡献中。

的MicroCal PEAQ-ITC分析软件可以在化合物的浓度中检测并证明误差，并有助于减少热力学测量中的任何错误导致。

图2显示了通过ITC确定的化学计量（n）的散射，用于使用微量自动ITC200系统进行的药物发现和开发项目中具有一系列LMW命中的靶蛋白的相互作用。范围在0.2a1.8之间的n值与无活性蛋白质分数不相关。

此外，基于复合物的X射线结构预测了1：1结合化学计量。显而易见的是，表观化学计量的变化是不精确的固定浓度测定的结果。

这些误差影响ITC产生的焓数据，因此使得难以理解每个配体的与靶蛋白的相互作用的变化难以理解。

图2。案例研究（客户提供的数据）。N值的概述获得靶蛋白与一系列LMW命中在微量自动自动ITC200进行的药物发现和开发项目中的靶蛋白的相互作用。

微量聚合酶AITC分析软件可以通过在注射器中使LMW配体浓度不同，以在装配过程中设置化学计量值为1的同时使LMW配体浓度合理。返回的焓数据和不具有此校正因子的校正数据如图3所示。

图3。在药物发现程序中返回一系列LMW命中的焓数据对药物发现程序中的靶蛋白的相互作用，（浅蓝色），没有（深蓝色）的配体浓度校正。化合物按降下的亲和力顺序列出。

显而易见的是，当在研究中考虑配体浓度的误差时，返回的焓数据是完全不同的，并且对该铅优化研究的结构活性关系（SAR）的解释具有重要影响。

错误配体浓度的另一个结果是，由于结合等温线的不完整性质，实验可能过于复杂而无法分析，可能需要再次进行。图4给出了一个示例。

图4。用于将LMW配体滴定到配体浓度的蛋白质中有显着误差的蛋白质的ITC数据的实例。原始ITC数据（上限面板）和安装在一个站点相互作用模型（下面板）的集成数据。在没有和（b）的情况下进行配合（a），核算复合浓度误差。下面面板中的插入包含分析软件返回的拟合参数。

的MicroCal PEAQ-ITC分析软件能够适应这些不完整的结合等温线利用恒定偏移，表示在拟合过程中的控制热。

通过改变配体浓度并将控制偏移结合在拟合过程中，可以以非主观方式自动研究现有的困难数据集。

在大多数情况下，这对应用来说是足够的，并可以用来确定复合原料药的精确浓度。

在该分析中，预期配体浓度为200μm，但注意到为126μm。此错误对熵（-TAS）和焓（AH）分别对2.28kcal / mol和-2.8 kcal / mole进行了重大影响，而K_D从241μm变为122μm。

这些变化强调了微量PEAQ-ITC分析软件中新颖功能的价值，以及它将带来强大的数据解释所带来的优势。

异构体和对映异构体的同时亲和测定

在药物开发的后期，大量化合物以异构体或对映体的混合物形式产生。在大多数情况下，化合物混合物可以通过高效液相色谱(HPLC)分离出来，并且可以单独测试一个或多个异构体。

然而，在某些情况下，分离可以非常困难并且需要大量的时间，因此在这些情况下，必须直接测试混合物。生物化学测定提供了关于混合物中最紧密的结合组分的数据，而ITC在单一实验中同时提供关于弱和强粘合剂的绑定数据。

图5。将对映体化合物滴定到靶蛋白的微量ITC200数据（客户提供的数据）。结合等温线显然是双相的;然而，具有原点ITC数据分析的数据的分析并不简单。

图5显示了双相结合等温线，证明了ITC信息如何将对映体配体混合物注射到细胞内的靶蛋白中。

同样地，当高亲和力配体与弱者配体刻意结合以确定k时，可以看到双相等温。_D超出直接测量范围。

图6。原料和归一化的热图，用于滴定的EZA和毛皮的1：1混合物进入BCaii。在细胞（左）中的注射器中的160pm的化合物的总浓度为160pm的化合物的总浓度，或在细胞（右）中BCaii的浓度为100pm，在细胞中的浓度（右）。制备18×2 Pl注射，缓冲液在25℃下PBS，2V / V％DMSO。

图6中描绘的数据表示预期对映体混合物或“注射器”竞争实验的双相等温数据的类型。

因此，这些实验表明可以通过微量PAPQ-ITC获得的分辨率，并提供定量表征混合物结合的可能性。

借助微量孔径PEAQ-ITC分析软件，与早期型号上可用的分析软件相比，复杂ITC数据的拟合已经更容易。

结论

的MicroCal PEAQ-ITC仪器，连同增强的信号稳定性，信噪比，和混合特性，特征数据分析软件，适合生物物理实验室涉及小分子药物发现。调查是完全自动化的，减少了用户在评估分析过程和数据质量的主观性。

数据质量和拟合过程的评估迅速进行，在几秒钟内能够分析大数据的实验。微量聚合酶AITC分析软件的重要特征使得在使用合适的对照时可以确定靶蛋白的配体浓度和活性浓度。这使得可以精确地确定热力学和亲和力，在铅优化和命中验证研究中实现精确的结构活动关系。

此外，ITC数据分析软件配备的工具可以简化复杂的结合等温线的拟合，当用对映体混合物滴定时，或用具有多个结合位点的目标滴定时，可以观察到复杂的结合等温线。

此信息已被采购，从Malvern analytical提供的材料进行审核和调整。欧洲杯足球竞彩

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