等温滴定量热法（ITC）结合蛋白和低分子量（LMW）的配体，药物发现和学术研究的焦点区域之间的交互期间，可以测量热发射或吸收。
有了ITC的这种能力，无需固定化或标记就可以研究蛋白质-小分子间的相互作用。表征配体结合中焓和熵的变化是ITC的另一个关键应用。
新MicroCal PEAQ-ITC系统
广泛亲和力范围是参与鉴定和结合相互作用的量化的一大挑战，因此需要加以解决。在典型的药物发现项目，结合小分子结合到靶蛋白的亲和力值的范围内从低毫亚纳摩尔变化。学术研究，同样广泛亲和力范围显著基于被分析的生化系统。
结合适当设计的分析和高灵敏度ITC仪器，可以极大地简化结合相互作用的表征。新Malvern Panalytical MicroCal PEAQ-ITC系统提高了信号的稳定性、信噪比和混合特性(图1)。
这些品质与并入用户友好的数据分析软件优化一个复杂的分析的设计特征结合分析挑战的相互作用。本文讨论了使用MicroCal PEAQ-ITC仪器和软件的直接和有竞争力滴定的手段结合相互作用调查的优点。
提高数据质量与MicroCal PEAQ-ITC
该实验通过用牛碳酸酐酶II滴定乙酰唑胺，将新的MicroCal PEAQ-ITC与早期版本的MicroCal iTC200进行了比较。
结果显示在MicroCal PEAQ-ITC的情况下，短期的噪音比MicroCal iTC200降低五倍。
这种改进的数据质量提高置信而具有低加热或学习挑战数据当样品是需要用于低纳摩尔亲和力相互作用的高精度定量昂贵或低浓度。
.jpg)
图1所示。用MicroCal PEAQ-ITC(上)和MicroCal iTC200(下)系统将20µM乙酰唑胺(ACZA)滴入2µM牛碳酸酐酶II (bCAII)，覆盖原始ITC数据。
结合亲和力范围广泛
牛碳酸酐酶II（bCAII）和人碳酸酐酶的滴定I（HCAI）用若干抑制剂进行演示新的适用性PEAQ MicroCal ITC系统为结合相互作用的表征。图2呈现了典型的数据集和表1总结了结果。
.jpg)
图2。Raw(上)和综合热(下)图滴定200µM速尿到20µM bCAII(左)，使用2µL注射;25µM乙氧唑胺到2.5µM bCAII(右)，使用1µL注射。
表1。总结了用一系列抑制剂滴定hCAl和bcai的结果(n=3)。
| 蛋白质 |
化合物,n = 3 |
N(网站) |
误差（N），％ |
KD(M) |
pKD |
错误（KD), % |
ΔH(千卡/摩尔) |
错误(ΔH), % |
| 卫生保健相关感染 |
磺胺 |
1．0 |
固定 |
3.2E-04 |
3.5 |
16 |
-5.9 |
15 |
| Ethoxzolamide |
1．0 |
1．0 |
1.9 e-08 |
7．7 |
7 |
-8.7 |
1 |
| bCAII |
呋喃苯胺酸 |
1．0 |
1．7 |
3.6E-07 |
6．4 |
18 |
-6.3. |
3. |
| 乙酰唑胺 |
0．9 |
0．6 |
1.8E-08 |
7．7 |
3. |
-12.6 |
3. |
| Ethoxzolamide |
0．9 |
0．3 |
4.4平台以及 |
9．4 |
95. |
-14.4 |
3. |
Ethoxzolamide Vinj = 1微升
|
1．0
|
1．0
|
1.3 e-09
|
8．8
|
76.
|
-15.1
|
1
|
所有的相互作用都是通过将18.2µL配体注入细胞内的蛋白溶液的标准程序进行分析的。K的误差D与18nM亲和力的相互作用均小于20%，在某些情况下小于10%，且较弱。
除磺胺外，焓和化学计量学数据的误差均小于3%。这些值揭示了PEAQ MicroCal ITC系统即使使用低蛋白浓度下降到2.5μM，以产生高度可重复的数据。
虽然ķD值变化剧烈的乙氧唑胺，最紧密的粘合剂，94%的误差是足够公平的这些紧密的相互作用，提供了一定的信心的数据。MicroCal PEAQ-ITC仪器具有低信噪比和高准确度，可以使用1µL的注射体积。
这种方法可以用更多的数据点填充转换区域，从而提高亲和数据质量(图2)。图3中显示的数据是pK数据D，这可能是比较亲和性数据更合适的方法。
.jpg)
图3。K的总结D用新的MicroCal PEAQ-ITC仪器和分析软件对hCAI(红色)和bcai(蓝色)的一系列低分子量抑制剂进行分析。误差条表示以pK为单位的误差D(误差在% KD表1)。
比赛滴定
在竞争实验中涉及下一个较弱的，有竞争力的化合物的存在下注入强结合配体到靶蛋白。对于ITC滴定，当弱抑制剂不存在的数据点的足够数量将不存在在过渡区域。它必须具有以适应一个独特结合等温线的过渡区域的数据点的足够数量。
图4A为将200µM乙氧唑胺注射到20µM bCAII中，共2µL。使用配备MicroCal PEAQ-ITC的竞争实验设计工具，可以实现理想的实验条件，确保有足够高的热值以获得更好的信号噪声和足够数量的过渡范围数据点(图5)。图4B显示了结果滴定。
.jpg)
图4。(A)直接滴定200µM EZA到20µM bCAII和(B)竞争滴定200µM EZA到20µM bCAII和100µM FUR的原始和集成ITC数据。
表2总结的结果显示，竞争滴定法获得的紧密结合剂的结合参数与直接滴定法获得的数据之间具有良好的一致性，表明竞争实验和设计工具的适用性，用于表征紧密结合的相互作用。
表2。在直接滴定25μMEZA成2.5μMBCA II得到EZA BCA II相互作用的结合参数和200μMEZA的竞争滴定到20μMBCA II预混与100μMFUR，Vinj =2μL。
| 实验装置 |
KD（nm）的 |
错误（KD), % |
ΔH（千卡/摩尔） |
错误(DH), % |
| 直接滴定法 |
０．４ |
95. |
-14.4 |
3. |
| 竞争滴定 |
０．４ |
40 |
-13.9 |
6 |
结论
结果表明，新的能力Microcal PEAQ-ITC系统提供具有改进的质量的数据。该仪器可由于其高信噪比量化宽范围的亲和力。
结果也证明了该系统在测量纳米摩尔亲和力方面的卓越重复性。此外，微摩尔相互作用的误差约为20%或更高，表明计算K的重复性是前所未有的D．
竞争实验的使用将ITC的亲和范围扩展到高皮摩尔范围。实验设计的复杂性是这种方法的一个主要缺点。MicroCal PEAQ-ITC分析软件中的仿真工具简化了设计和分析。
MicroCal PEAQ-ITC系统除了提高了信噪比、数据分析完全自动化、降低了用户在确证数据质量方面的主观性、缩短了分析时间之外，还具有其他优点。
以确定的数据质量，并执行分析每几秒钟内装配的能力使得仪器来分析的短时间内的50层或更多的分析大型数据集。
.png)
这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．