在蛋白质样品中确定组分及其比例对于改善候选制剂和最终制剂的表征是必不可少的。这种类型的信息可以使用尺寸排阻色谱（SEC）或凝胶渗透色谱（GPC）传统地获取。
SEC通过一套已知分子量的标准，通过大小排除或凝胶渗透柱，比较分析物分子的移动，通过其分子量来识别样品组分。此外，还可以从各自的峰区域提取各组分的相对量。用浓度检测器记录洗脱过程以确定相关的消光系数。
柱校准SEC是一种成熟的技术，但它会引入不准确的分析通过形状依赖的洗脱。相反，多检测SEC，配备了色谱的分辨能力和光散射探测器和粘度计的揭示能力，可以产生更准确的数据和更全面的蛋白质混合物的特性。本文通过对两种抗体样品的表征说明了多检测SEC比柱校准的优越性。
欧洲杯足球竞彩材料和程序
柱校准标准品在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中制备，最终浓度约为1-3 mg/mL，使用一个排除标记和一个由6个球状蛋白组成的蛋白分子量标记试剂盒。然后在最终浓度为2-3mg/mL的PBS中制备两份来自不同有机体的多克隆免疫球蛋白G (IgG)样本。
使用0.2μM醋酸纤维素膜来过滤所有样品。对于最容量经济的样品递送，微升拾取模式用于将100μl的三个复制喷射施加到尺寸排除柱组（2x Viscotek P3000，Malvern analytical）。OMNISEC系统用于使用PBS作为移动相以1ml / min的流速执行所有测量。通过将样品托盘，探测器隔室和在25℃下保持的样品托盘，探测器隔室和柱进行数据采集。
实验结果
IgG色谱:折光指数
折射率检测器用于监测两个IgG样品的洗脱曲线（图1）。对样品进行定性比较，并且通过覆盖色谱图来辨别它们的相对组合物。使用尺寸排除理论，主峰上游的峰值，保持体积（VR）约为16.0ml表示IgG单体的聚集体，其具有逐渐较大的流体动力学尺寸。相反，主峰下游下游的次要峰可能代表具有小型流体动力学半径的盐分子。
.jpg)
图1所示。人IgG(红色)和羊IgG的代表性RI图谱的叠加图。(紫色)
用SEC柱校准IgG样品
为每种蛋白质标准的分子量（Log Mw）的对数为蛋白质保留体积与柱空隙体积（Vo）的函数进行。通过线性地拟合数据获得校准参数，并用于计算IgG样品的色谱图中峰的分子量（图2）。
.jpg)
图2。SEC列校准曲线绵羊（横跨）和人（钻石）IgG数据叠加。
表1总结了这些计算出的Mw值和其他通过柱校准确定的定量属性:
表格1。SEC柱校准结果总结。
|
人IgG. |
羊免疫球蛋白 |
| 峰1 |
峰2 |
峰3 |
其他 |
峰1 |
峰2 |
其他 |
| 虚拟现实(毫升) |
13.80 |
14.69 |
16.51 |
> 13.00 |
14.60 |
16.44 |
> 13.80 |
| MW（KDA） |
627.2 |
398.9 |
158.1. |
- |
417.6 |
163.8 |
- |
| 身份 |
四聚物 |
n / d |
单体 |
高阶总 |
n / d |
单体 |
高阶总 |
IgG样品的多检测SEC分析
表2总结了使用多检测器SEC获得的人类和绵羊IgG样品的定量特性，在人类IgG峰1-3估计的绝对Mw值与三聚体、二聚体和单体物种的期望值之间显示出良好的一致性。同样，绵羊IgG峰1和2对应的Mw值与单体和二聚体种类一致。
表2。总结了多探测器交会分析的结果。
|
|
人IgG. |
羊免疫球蛋白 |
| 峰1 |
峰2 |
峰3 |
其他 |
峰1 |
峰2 |
其他 |
| MW（KDA） |
459.0 |
299.5 |
147.5 |
722.8 |
306.7 |
152.0 |
551.7 |
| Pd |
1.0008. |
1.0002 |
1.0002 |
1.0334 |
1.0010 |
1.0002 |
1.0697 |
| RH（NM） |
8.2 |
6.7 |
4．8 |
11.0 |
6．8 |
5．0 |
8．8 |
| 第四(dL / g) |
0.086 |
0.068 |
0.049 |
0.159 |
0.064 |
0.051 |
0.097 |
| 身份 |
三聚物 |
二聚体 |
单体 |
高阶总 |
二聚体 |
单体 |
高阶总 |
| %的作文 |
2．4 |
11.4 |
84.9 |
1.3 |
11.6 |
85.6 |
2．8 |
粘度计的数据可以计算两种IgG单体的流体力学半径。当比较这些值时，两个IgG样品各自的洗脱顺序是合理的(图3)。还可以观察到两个分子之间的聚合组成的变化。人类样品中三聚体的比例高于绵羊样品，这可能揭示了该样品的稳定性或聚集途径的变化，因此需要进一步分析。
.jpg)
图3。多探测器SEC色谱图的人和绵羊IgG样品 - 折射率（红色），直角光散射（绿色），低角度光散射（黑色），粘度计（蓝色），紫外线（紫色）。物种的分子量在橄榄中显示。
柱校准SEC中与形状相关的不准确性
从结果，用柱校准SEC获得的分子量值高于多检测器SEC值。对于代表单体（在两种情况下）的峰，可以从MW中鉴定单体物质。相反，在诸如二聚体的聚集峰中，MW值与预期值的偏差高达28％，无需确定识别。
这些不准确是由于形状对抗体分子的洗脱和它们通过柱基质聚集的影响。根据尺寸排斥理论，流体力学体积决定了蛋白质分子的柱渗特性，是结构和质量的函数。因此，具有特定分子量的蛋白质具有较低分子量的蛋白质更小或等价的水动力体积，具有密集的原子和细长的结构。
使用这两种不同形状的分子链来构建校准曲线会得到不同的斜率。球状蛋白在柱定标中的应用使样品具有球状形状的假设。然而，如果抗体的结构是y型而不是球状的，这种假设会导致随着分子尺寸的增加，分子量的错误值。
结论
结果清楚地表明，多检测器SEC优于柱校准SEC。多检测器SEC提供了所有离散峰到特定寡聚态的最终分配，并有助于识别和量化样品之间聚集态的变化。这些数据有助于生物制药制造商确定并洞察各种配方或在各种条件下的各种候选药物的行为特征。因此，最终药物的生产和疗效可以得到有效控制。
Malvern Panalytical公司的OMNISEC系统对测量几微克或更少的样品具有灵敏度。此外，使用OMNISEC系统的自动进样器可以不浪费地进样，并且可以保持在凉爽的条件下，以避免样品在等待测量时聚集。这些特性使OMNISEC系统适合于生物制药和蛋白质的特性。
.png)
这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问马尔弗恩帕尼特．