使用多检测尺寸排除色谱法（SEC）的洞察蛋白质混合物组成

多检测尺寸排除色谱法（SEC）是色谱柱色谱和光散射，超紫罗兰色（UV），粘度计和折射率（RI）检测器的组合，使其成为可靠的分析工具。将多检测SEC纳入需要有效分析蛋白质混合物的过程的工作流程中很容易。本文描述了包含β-淀粉酶的半纯化蛋白混合物的分析（图1）。

图1。甘薯的β-淀粉酶的多探测器色谱图（主要）；来自红薯的β-淀粉酶的晶体结构（插图，PDB ID：1FA2）。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中制备由红薯β-淀粉酶组成的半纯化混合物的溶液，浓度约为2mg/ml。然后使用0.2 µm乙酸纤维素膜过滤所得的溶液。分析尺寸排除柱（2 X Viscotek P3000，Malvern Panalytical，UK）用于蛋白质混合物的色谱分离。

流动阶段是磷酸盐缓冲盐水。通过将样品，柱和检测器保持在25°C时进行数据采集。零废物注入模式用于将100 µL的等分试样应用于色谱柱上。具有OmniSec的完整OmniSec系统揭示了检测器模块和OmniSec Resolve分离模块，用于执行所有测量。

结果与讨论

解构的多探测数据的解释

多检测SEC提供有意义的数据。每个检测器显示出对洗脱蛋白分子的特定特性的响应，这些反应统称为分析的每种蛋白质的特征指纹。

RI检测

RI检测器用于常规色谱法以通过列监测样品组件的洗脱。图2中的面板A中显示了β-淀粉酶混合物的RI洗脱曲线。_r14.60 mL（峰值1）和15.97毫升（峰2）。首先洗脱的分子具有较大的流体动力大小。通过应用大小排除原则，可以得出结论，两个物种具有不同的流体动力特性。

RI和光散射信号的组合

浓度检测器和静光散射探测器的组合可以使用雷利方程来确定分子量。但是，可以通过对原始色谱图应用更简单的计算来比较两个不同峰的表观分子量。从简化的瑞利方程式来看，可以得出结论，峰值分子的明显分子量与光散射信号与浓度（LS/C）的比例成正比。

该输入在多检测色谱图中应用于信号，可以得出结论，如果两个蛋白质峰的LS/C比相同，则它们的明显分子量必须相同。图2中的面板B中显示了RI和光散射信号的覆盖层。有趣的是，对于两个峰，RALS/C和LALS/C比相同。

RI检测和粘度法的组合

有两个条件可以描述该样品如何与相同分子量但暂时不同的V的峰产生色谱图_r。第一个条件是样品由具有不同流体动力学大小的两个结构上不同的β-淀粉酶组成。第二个条件是样品可能由两种不同流体动力大小但分子量相同的不同蛋白质组成。

粘仪差异（DP）和浓度反应的比率（V_DP/c）评估以通过数据来证实这些假设的验证，从而确认这些假设不仅是运行条件或列降解的伪像。可以通过取出V来得出近似固有的粘度值（IV）_DP/c比从下面的图2中图2中显示的峰的顶点。由于更开放的结构具有较高的IV，因此可以合理地将峰值1的早期洗脱具有较大的流体动力大小。

浓度探测器的见解

从浓度检测器获得的数据可以帮助理解上述哪些可能性最佳代表β-淀粉酶样品。RI检测器对流动相和洗脱蛋白分子之间的折射率变化产生信号，而紫外线检测器则在特定波长处响应于吸收紫外线吸收的紫外线，产生信号。

在这两种情况下，这些信号的大小都与蛋白质浓度成比例。但是，如果已经知道了所研究的蛋白质的相关系数-DN/DC和DA/DC，则可以确定特定点或峰下的绝对浓度。蛋白质测量通常涉及使用0.185 mL/g的DN/DC值。这意味着大多数蛋白质的浓度可以使用RI直接确定。但是，DA/DC在紫外线的情况下取决于蛋白质，具体取决于每个蛋白质分子中存在的发色团的类型和数量。

如果两个蛋白质分子在组成方面是相同的，但流体动力大小不同，则RI和UV信号之间的比率（RI/UV）对于蛋白质而言都是相同的，因为DN/DC和DA/DC比率相等。然而，β-淀粉酶混合物在峰1和2中显示出不同的RI/UV比（图2，面板D）。由于这些蛋白质的DN/DC相对恒定，因此DA/DC极大地有助于RI/UV比率的差异，表明峰1是完全不同的蛋白质，而不是β-淀粉酶的聚集体。

图2。多探测器色谱图：（a）RI响应（红色），（b）RI（红色）和光散射响应的覆盖（绿色和黑色），（c）RI（红色）和Viscometer响应（蓝色）的覆盖（c）d）RI（红色）和UV（紫色）响应的覆盖。B-D面板中的峰值分别用RAL与RI，LALS与RI，Viscometer与RI和RI和RI与UV的比率进行注释。

图3和表1介绍了处理多检测数据的结果。这两个峰具有非常相似的分子量，但流体动力半径不同。RI检测器显示，大约30％的样品混合物为峰值1，而混合物的70％为峰2。呈甘薯β-淀粉酶的摩尔灭绝系数，UV检测器有助于识别峰2为β-淀粉酶。这意味着污染蛋白是峰值1。

图3。与MW的多探测器色谱图的叠加。

表格1。从数据处理获得的定量结果摘要。

范围	ind。1个β淀粉酶
	峰值1	峰2
RV（ML）	14.60	15.97
MW（g/mol）	209,200	214,200
pd（）	1.001	1.001
IVW（DL/G）	0.1572	0.05705
RHW（NM）	8.034	5.771
果样品（％）	28.61	71.39

结论

本文讨论了多探测数据的分析，以洞悉β-淀粉酶半纯提取物的组成。多检测数据提供的数据比从单个检测器获得的数据更有意义，这表明样品是主要蛋白质和某些聚合材料的混合物。

相反，多检测数据表明，次级峰不是骨料，而是完全不同的污染蛋白。尽管污染蛋白的分子量与β-淀粉酶相同，但其紫外线反应表明它将是不同的分子。粘度计数据表明，两种蛋白质具有不同的结构，尽管分子量相似，但仍导致洗脱体积的差异。

尽管这种污染蛋白的身份仍然未透露，但多探测器SEC数据有助于得出结论，即样品是两种具有非常相似分子量的不同蛋白的混合物。仅凭任何一个检测器就不可能得出这个结论。使用高级多探测器SEC系统，例如Omnisec在蛋白质领域，研究人员可以获得有关其蛋白质样品组成的新见解，并辨别了其他污染物的聚集体，从而使这种纯化的蛋白质的全面表征能够进行全面表征，以及当它们被用作生物药物药物或在其中时对其行为的理解。测定。

此信息已从Malvern Panalytical提供的材料中采购，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

有关此消息来源的更多信息，请访问Malvern Analytical。