使用原子力显微镜（AFM）观察到的第一生物分子是DNA。对于研究DNA结构，动态，拓扑和与蛋白质的相互作用，成像的主要技术仍然是AFM。
使用独家的PeakForce点击®通过布鲁克的技术，可以在可以量化的成像力下对DNA双螺旋进行高分辨率成像，而不需要限制性的AFM设计或专门的探针。
原子力显微镜在生物研究中的应用
AFM已广泛用于生物研究，从TAPPMODE™在90年代初推出时。在TappingMode中，探头的振荡在其基本的共振频率下进行，并且尖端的垂直位置连续调节，以保持恒定的振荡幅度，因为探头扫描表面扫描。
TappingMode在学习生物样本结构的同时提供了几个好处，但批评者认为与接触模式成像相比，它提供了生物分子的低分辨率图像。
PeakForce tap模式用于生物分子的常规高分辨率成像
的PeakForce tap AFM成像模式于2010年由布鲁克推出，在很短的时间内，它已被广泛用于研究生物分子。尖端采样距离以正弦运动调制，其振幅通常低于100nm，频率在PeakForce tap模式下为1或2kHz。
如图1A所示，当AFM探针与样品表面接触时，通过将峰值力或尖端和样品常数之间的最大力控制来控制尖端样品相互作用。考虑到z位置的探针移动，在样品表面上的每个像素位置执行力曲线（图1b）。
PeakForce点击的好处是，它使用了一个恒定的反馈循环来调整相对的尖端样品位置。PeakForce tap采用正弦斜坡代替线性斜坡，因此当尖端接近表面时，尖端速度接近零。这些特性确保了针尖-样品相互作用力的准确和直接控制，使成像流体在力为100pN或更小。
因此，样品和AFM探针都不会受到损坏。此外，与其他基于力距曲线的成像模式相比，PeakForce tap成像速度更快。每秒成千上万的力曲线可能与峰值力敲击，因为它操作在非常高的频率(1-2kHz)。
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图1所示。在峰值力攻丝模式下，AFM探头被调制在低频(1-2 kHz)。(A)当探针与表面接触时，反馈信号是施加于表面的最大或“峰值”力。(B)如果用Z位置来考虑探针的运动，那么本质上就是在样品表面的每个位置上执行一个力曲线。
PeakForce tap技术还启用了自优化ScanAsyst成像模式。使用ScanAsyst，由于成像设定值的优化，可以防止由于悬臂偏转漂移和/或共振峰漂移而在其他AFM工作模式下发生的设定值漂移。
由于每个针尖与样品相互作用点的成像力都是自动优化的，因此使用PeakForce tap技术可以获得高分辨率的图像。伴随着ScanAsyst模式中其他参数的自动优化，例如增益和扫描速率，PeakForce tap使快速和可靠的数据，不管用户的技能水平。
通过对单个病毒衣壳的成像，可以说明PeakForce tap的性能。在以往涉及TappingMode的研究中，病毒粒子的排列是在二维晶体结构中进行的。欧洲杯猜球平台
这种二维阵列为病毒粒子提供了机械稳定性，因此当使用AFM探针时，它们不会被破坏。欧洲杯猜球平台考虑到病毒衣壳非常脆弱，利用“跳跃模式”可以获得AFM高分辨率图像。
就像在PeakForce tap中一样，在跳跃模式下，沿着快速扫描轴使用力曲线导出的地形数据创建离散的力曲线。然而，对于PeakForce tap中的每个单独的力曲线，由于流体中悬臂运动引起的粘性阻力，背景伪影被实时反馈回路减去。通过去除背景，提高了峰值力检测的灵敏度，可以部署较低的成像力。
图2显示了单个单纯疱疹病毒的PeakForce点击图像。蛋白质分子以三维亚基的形式排列在病毒衣壳表面，称为衣壳。这些现在非常清晰可见。重要的是，这些病毒颗粒的成像是作为孤立的和独立的颗粒进行的，没有横向稳定。欧洲杯猜球平台
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图2。在缓冲溶液中使用ScanAsyst模式获得的单个单纯疱疹病毒的三维地形图像。在AFM图像(ScanAsyst Fluid+ probe, k~0.7N/m)中可以清楚地看到病毒衣壳表面单个蛋白质分子的空间排列，也称为衣壳。
DNA双螺旋结构的峰值力攻丝成像
另一个理想的样本基准PeakForce攻是DNA。它已经被AFM广泛成像，是第一个用于证明TappingMode是理想的生物分子成像样本。DNA由两条多核苷酸链组成，形成双螺旋结构。
B-DNA是DNA的“沃森-克里克”形式，它是右手螺旋的形式，螺旋重复(螺距)为~3.6nm，小槽和大槽宽度分别为~2.2nm和~1.2nm。本文列举了一种技术，通过使用标准悬臂和PeakForce tap可以成像DNA的二级结构。
为了成功地成像DNA双螺旋，样品的制备是非常重要的。云母通常用于AFM成像。然而，在中性pH下的云母具有负表面电荷，不允许吸附带负电荷的DNA。
已经部署了许多方法来克服这一点，所有旨在使云母官能化的方法开发DNA可以附着的正界面。2012年，Leung等人。使用1-5mm浓度的NiCl成功地对一个DNA分子的次要和主要凹槽进行成功进行成像2DNA在云母表面的吸附
这种低浓度减少了对DNA链的不利结构影响，并最大限度地减少了表面污染，然而，它也使DNA松散地结合在云母表面，并为高分辨率成像带来了更大的挑战。
研究人员使用与Leung等人的相同的DNA固定方法。，用于通过通过Pyne等人实现的Peakforce攻丝模式展开低和精确控制的成像力来对松散结合DNA的螺旋结构进行成像。
PeakForce tap实验在Dimension FastScan Bio, MultiMode 8和BioScope Resolve™原子力显微镜上进行(图3)，使用MSNL-F, FastScan- d, ScanAsyst Fluid+和ScanAsyst Fluid- hr探针，所有这些探针都有标准的硅探针。
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图3。使用Peakforce Tapp和标准AFM探头，在Bruker的高性能BioAFM系统中显示DNA双螺旋的成像：（左）维度Fastscan Bio AFM，（中间）多模8 AFM，（右）Bioscock解决AFM。
在10mM HEPES, 1mM NiCl, pH 7.4中对MultiMode 8进行PeakForce攻丝成像时，沿着DNA双螺旋小槽和大槽对应的DNA链观察到波纹(图4A)。
图4A示出了使用扫描器流体-HR探针在相同的成像条件下在倒光显微镜下操作的自体镜拍摄的高分辨率图像。该图像分别显示分别为2.2和1.2nm的交替主要和次要凹槽的宽度。
为了评价表面结合DNA的移动性，将质粒DNA用1mM NiCl固定在云母表面，对质粒DNA进行连续高速TappingMode成像2(图4B)，使用FastScan- d探针和FastScan生物原子力显微镜，其特征是一个标准的硅尖端和一个小悬臂。
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图4。(A)用Multimode 8和MSNL-F探针在缓冲溶液中拍摄的DNA质粒的PeakForce攻丝图像(k~0.6 N/m)，显示出与DNA双螺旋的大小沟槽相对应的波纹。该插图是使用BioScope Resolve在倒置光学显微镜和ScanAsyst Fluid-HR探针(k~0.05 N/m)上操作获得的DNA质粒的高分辨率图像。沿链横截面的虚线显示出主沟槽和小沟槽的交替宽度分别为2.2 nm和1.2 nm。(B)时间序列的高速AFM图像获得的相同类型的质粒DNA在TappingMode显示低NiClconcentration DNA的某些部分仍然固定在连续成像(绿色箭头),而其他部分相同的链表现出高度的运动(红色箭头)。利用FastScan- d探针(k~0.2 N/m)在FastScan Bio AFM上进行高速成像。
沿着DNA长度，可以观察到地形的高度变化，表明DNA链的扭曲(图5A)。这也表明，低镍２＋浓度使DNA能够在云母表面上保留更生理的相关结构。
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图5。（a）缓冲溶液中捕获的DNA质粒的形貌图像。局部高度变化沿分子可见，因为颜色（白色到红色）的变化。（b）（I-III）分别在39,70和193pn的峰值力上成像的DNA质粒，其中DNA双螺旋的主要和较小凹槽可视化（INSET）。彩色鳞片：3nm（低放大率）;2 nm（对于插入）。（IV）在DNA上测量的高度曲线，如B的插入中的虚线所示，用于不同的峰值力。（v）作为峰值力的函数，在分子（作为IV）上的相同部分测量高度。图5（b）具有来自Pyne等人的许可。
与其他间歇接触模式相比，PeakForce轻敲的独特优势在于，它可以在任何时候量化成像力。
图5B(i-iii)显示了力对AFM形貌的影响，使用MSNL-F探针在Multimode 8上使用PeakForce tap模式。为了清楚地显示DNA压缩是如何随着尖端取样力的增加而发生的，所有图像的高度比例都保持不变。
在施加最小峰力39pN时，确定的质粒高度接近其晶体结构获得的DNA直径2nm。可能是由于在这些低力下很难跟踪分子，因此在相应的高分辨率图像中，沿着DNA链的长度可以看到非常少量的波纹，如图5B(i)所示。
在施加70pN的力下，观察到大约20%的分子压缩，使质粒的确定高度降至~1.6nm。如图5B(ii)的插图所示，在这种力作用下，可以清楚地看到波纹。小调和大调槽在100pN之后变得不清晰(图5B(iii))，和前面一样TappingMode AFM实验在液体中，确定的高度降低至小于1.5nm。
在这一点上，还有一个风险，样品可能会从云母表面脱节的分子运动，如白色箭头所示。从图5B(v)可以看出，在50pN左右或以下施加力时，确定的高度和DNA直径是一致的，但对于二级结构的解析，可能需要施加稍微大一点的力。
图6显示了使用PeakForce轻敲FastScan Bio和FastScan- d探针捕获的DNA质粒的高分辨率图像。图中显示了与双螺旋结构相对应的波纹。为了进一步研究这一结构，扫描尺寸被缩小到白盒突出显示的较小区域。
图6B示出了该较小扫描区域的高分辨率图像，其中次要和主凹槽清晰可见。在两条迹线和回溯图像中，清楚地看到双螺旋结构，并且还在几个时间顺序所示的后续扫描中。白色箭头描绘了扫描方向。
小沟槽和大沟槽显示了沿着链的深度变化，这在跟踪和回描扫描之间以及在进一步的图像中都可以再现(图6C)。这表明，PeakForce攻丝模式不仅解决了DNA双螺旋结构的亚分子特征，而且还可重复捕获这种螺旋结构的变化。
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图6。使用FastScan Bio AFM和FastScan- d探针(小悬臂和标准硅探针)获得的DNA质粒形貌中沟槽深度变化的PeakForce攻丝图像。(A)质粒呈波纹状的低倍AFM形貌图。白色矩形表示在B中成像的区域。(B)在连续的图像中，该区域的高倍示踪(白色箭头向右)和回描(白色箭头向左)图像显示出与DNA B形式一致的波纹。(C)沿着B中所示的直线跟踪(实线)和回描(虚线)高度轮廓，紧密跟随四个质粒扫描的主干，平均超过5像素(~0.5)宽。高度剖面证实了所观察到的波纹是双螺旋结构中主次交替的沟槽，这些沟槽沿DNA链的深度不同。高度轮廓被0.6 nm的倍数所抵消。色阶:3.5 nm (A)， 1.1 nm (B)。经Pyne等人允许复制。
结论
PeakForce开发模式提供精确的力控制和容易地定量尖端 - 样品相互作用力，允许在100pN以下的力下成像，以便在流体环境中获得高分辨率的软生物样品的图像。
通过部署来自Bruker的MultiMode 8、Dimension FastScan Bio和BioScope Resolve原子力显微镜，已经证明PeakForce tap模式能够以高分辨率在单个质粒上成像DNA双螺旋的主要和较小的groves。
此外，已经证明这种亚分子分辨率可以在不需要专门的探针或专门的AFM设计的情况下实现。
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这些信息来源于布鲁克纳米表面公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩
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