等温滴定量热法的工作原理

等温滴定量热法(ITC)是一种分析技术，常被认为是分析分子间相互作用的金标准。它是一种滴定法，是一种定量化学分析的容量技术，其中试剂溶液，滴定剂，与分析物或滴定溶液反应。

滴定是在恒定的压力和温度下进行的，这意味着一个单独的ITC实验提供了结合焓、平衡缔合常数和化学计量数的数据，从这些数据可以计算结合熵和吉布斯能。因此，一个ITC实验可以直接获得与相互作用过程相关的关键热力学势——吉布斯能、焓和熵。

研究结合相互作用的ITC

ITC符合一项旨在研究结合相互作用的实验技术的标准要求。ITC直接确定在恒压下反应过程中的热量，Q_T.，与此过程的摩尔焓变ΔH(以非连接态为参考)和形成的大分子配体络合物量成正比:

（1）

在V₀为量热池的体积，[M]_T.是细胞中大分子的总浓度。第一个条件意味着相互作用的焓（即复杂地层的焓）与零不同。第二个条件是从第一个条件实现的，如q_T.与装订过程的推进成正比:

（2）

如果满足以下条件，可以以无模型的方式使用公式1和2来估计束缚焓:

• 实现宏观分子的完全饱和度或m_L./ M_T.接近于1
• 对参考背景热进行适当的减除
• 用合理的精度确定蛋白质浓度

ITC的优势

与其他生物物理技术相比，其主要优势是:

• 在一个单一的实验中完成基本的热力学表征(化学计量，缔合常数，结合焓)
• 热量是通用信号，因此，不需要报道标签（例如发色团，荧光团）
• 直接测定结合焓
• 非破坏性技术
• 互动解决方案
• 用光学致密的溶液或异常系统进行实验的可能性（例如，分散，完整的细胞器或细胞）
• 相当快(从单次注射实验的0.25小时/分析到常规滴定实验的2小时/分析)。

ITC的缺点

然而，也有一些缺点:

• 信号与结合焓成比例，非共价复合物可能表现出相当小的结合焓
• 热是一种普遍的信号，每个过程都对全球测量的热有贡献，因此由于约束性，对贡献的评估变得复杂
• 需要大量的样本，虽然这已经大大下降
• 它是一种慢速吞吐量的慢速技术（0.25-2小时/分析），不适合HTS
• 动力学上缓慢的过程可能会被忽略
• 一直测量的结合亲和力的有限范围（来自104-10M的关联常数^-1用于传统的滴定实验
• 在此之前，我们无法获取到任何关于结合相互作用的动力学信息

基本平衡热力学

当具有单一结合位点的大分子与配体在一定的实验浓度下混合时，可逆结合反应的程度或大分子-配体配合物的浓度[ML]由平衡缔合常数Ka给出:

（3）

K_D.为配合物的平衡解离常数，[M]和[L]分别为游离大分子和配体的浓度。这两个常数都与(标准)结合吉布斯能(ΔG)有关:

(4）

其中T是热力学温度或绝对温度，R是气体常数。

缔合常数越大，解离常数越小，结合吉布斯能越负，形成的配合物越强。

由式3得到了众所周知的大分子配体复合物的摩尔分数与自由配体浓度之间的双曲线关系:

(5）

从这个方程，可以推导出形成的大分子配体络合物的浓度，因此，与此形成相关的热可以很容易地通过乘以总蛋白质浓度和摩尔结合焓计算出来。然而，在滴定实验中，游离配体的浓度是未知的，控制的浓度是大分子和配体的总浓度。因此，公式5不能用于滴定分析。

绑定Gibbs能量可以分配到其焓，ΔH和熵，Tδs，贡献：

（6）

特定相互作用的基本热力学结合曲线包括三个关键的结合参数吉布斯能(由平衡缔合常数K计算得出)_一种），焓和结合的熵。结合这三个热力学潜力提供有关绑定过程的基本和有价值的信息。

结合热力学的直接测量

如前所述，单个ITC实验为给定的绑定相互作用提供完整的基本热力学型材。实验方法涉及以完全自动化的方式从注射器中从注射器中从注射器中进行几次滴定剂注射（通常是配体）进入细胞中的滴答液（通常是大分子），同时在同学，准等温条件下保持系统。

通过配体的连续注入，化学平衡被配体注入引发的反应物浓度的增量变化所扰乱，系统经历了几种不同组成的平衡状态，由于自由大分子和配体结合大分子之间的划分是基于平衡(缔合或解离)常数和大分子和配体的总浓度:

（7）

其中下标I表示沿滴定方向的注射次数，每次注射后大分子和配体的总浓度为:

（8）

在[M]₀和[L]₀分别为细胞内大分子初始浓度和注射器内配体浓度，v为注射体积，(1- v/ v₀）因子是在以恒定体积运行的量热细胞中发生的稀释度。

配体注入引发的两个连续状态之间的每一个转变，都与吸收或释放热量有关，热量的吸收或释放与注入引起的络合物浓度和摩尔焓的变化成正比:

（9)

ITC是一种有限差分或增量技术。

图1显示了具有单个配体结合位点的大分子的典型量热滴定。

图1。大分子与配体结合的量热滴定，结合参数如下:K_一种= 10⁶m^-1，ΔH= -5千卡/摩尔。上部曲线：热分析器（在量热计中保持零温度差的热功率，显示热量计的样品细胞），显示与每个配体注射相对应的峰的特征序列。下图：结合等温线（作为摩尔比的函数的归一化热量，[L]_T./ [M]_T.，在量热单元中。上插图:随着滴定的进行，量热池中自由大分子(开方)和大分子配体复合物(闭方)的摩尔分数的演化。下插图:大分子-配体相互作用的热力学结合曲线;在这种情况下，焓和熵的贡献都有利于结合。可以清楚地观察到，最后一个峰值的平均值并不能很好地估计注射背景热(所谓的“稀释热”)。

可以使用参数N in对标称蛋白质浓度进行归一化，从而获得非分数N值(图2)，因此，对蛋白质溶液进行“滴定”。

图2。大分子浓度不确定度对量热滴定中结合参数估计的影响。(左)N的分数值(0.72±0.01)是通过使用名义浓度(注射器中的配体为230 pM，细胞中的大分子为29 pM)的数据分析获得的。因为在这种情况下，配体浓度被认为是相当准确的，分数值表明，估计的蛋白质浓度过高，误差为28%。采用按照N (21 μ M)归一化的蛋白浓度，可以得到预期的非分数比1:1化学计量(N≈1)(右)。因为只有细胞浓度被改变，缔合常数和结合焓保持不变。如果修改了注射器浓度，这两个参数也会发生变化。

为了在分析实验滴定时适当地应用9式，并获得对结合参数的良好估计，需要解决“稀释热”问题。

有三种方法可以消除这种非比热效应的影响:

• 进行对照实验，将配体稀释到缓冲液中，并减去配体-大分子滴定所产生的热量;
• 取配体-大分子滴定法中最后一次注入(接近大分子饱和)的热平均值，然后从数据中减去这个值
• 在方程9中引入一个额外的可调参数Qd，用于计算注入背景热

第三种选项是当稀释实验没有必要时模仿当存在大分子时的注射背景效果的第三种选择。

ITC可访问的定量信息

理论上，可以从一次滴定中确定平衡缔合常数、结合焓和化学计量数。

然而，该估计的一致性是基于绑定亲和力和实验设置。可设置无量纲参数c，其中:

C = K._一种[M]₀= [M]₀/ K_D.

• 如果1 < c < 10000，则可以同时精确地确定这三个绑定参数
• 如果c > 10000，则只能测定结合焓和化学计量比
• 如果c < 1，只有平衡缔合常数可以确定，因为结合焓和化学计量数将相互关联

图3显示了基于c值的三个不同场景。

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图3。不同c值的量热滴定:(左)c = 0.1, K_一种= 10⁴m^-1；（中间）c = 100，k_一种10⁷m^{- 1}；(右)c = 100000, K_一种= 10¹⁰m^-1．ΔH = -10千卡/摩尔，[M]₀= 10 pm，[l]₀= 100 pM, V₀= 0.2ml，v = 2 pl。由于滴定的进展，插入显示大分子 - 配体复合物（大分子饱和度）的摩尔分数。很明显，低C的情况将是有问题的：非常低的信噪比和具有拟合参数之间的具有潜在相关性的无特色绑定等温度。而且，具有高C的情况将是有问题的：可以估计判断结合亲和力的可能性，并且可以估计关联常数的较低限制值。C和ΔH的值确定了结合等温线的几何特征。In particular, the global deflection of the binding isotherm (difference between the intercept with the y-axis and the heat observed at high saturation, i.e. background or "dilution" heat) is directly related to binding enthalpy, and it is equal to c/(c+1)ΔH.The slope of the binding isotherm at a molar ratio of 1 is directly related to the binding affinity and the binding enthalpy, and it is roughly equal to -0.25c^1／2ΔH。当c >1时，结合等温线将有一个拐点。

由于滴定曲率是基于参数c，给定一个结合亲和力，可以通过选择大分子浓度来调节该曲率。即使理想的情况是1 < c < 10000，也不总是可能在这个窗口内工作，因为这可能意味着使用非常低的反应物浓度。如果实验系统显示增加的(c > 10000)或很低的(c < 1)亲和度，置换滴定，包括一个中等亲和配体，有助于克服这一困难。

实验程序可以设置如下:

• 通过将每个配体注射到大分子中进行两次滴定
• 通过将其中一种配体注射到预先与第二配体结合的大分子中进行第三次滴定(如果可能，过量注射第二配体)
• 可以用单个绑定站点模型分析所有滴定，二进制和三元。

恒压下的结合热容是结合焓的温度导数:既不是独立的，也不是竞争的。图4显示了这两个实验系统的过程。

图4。用ITC评估异质相互作用。对于一个大分子结合两种不同的配体，可能有三种情况:独立结合、协同结合和竞争结合(最大负协同性)(左)在没有配体2(封闭方)和有配体2 (220 pM，开放方)的情况下，大分子(30 pM)与配体1 (480 pM)的滴定。使用配体1单一结合位点的模型对两种滴定进行分析，得到以下参数_一种-10 = 1.1⁷m^-1，ΔH.₁= -5.2千卡/mol, K_一种12 = 3.1-10¹m^-1，ΔH.₁₂= -8.4千卡每摩尔。第三次滴定配体2(未显示)提供以下参数:K_一种2 = 1.5 -10⁵m^-1，ΔH.₂= 3.1千卡每摩尔。因为Eq. 15不成立，配体1和配体2的结合不是独立发生的。另一方面，考虑205pm作为配体1滴定过程中自由配体2的平均浓度，应用式16的值计算配体2存在时配体1的结合参数，K_一种12 = 3.5 -10⁵m^-1和ΔH₁₂= -8.2千卡/摩尔，与直接测定的结果非常接近(在实验误差范围内)(即满足式16)。(右)配体1 (260pm)和配体2 (50pm)在没有配体2(封闭方)和有配体2(开放方)的情况下的大分子(21pm)滴定。使用配体1单一结合位点的模型对两种滴定进行分析，得到以下参数_一种-10 = 9.2⁵m^-1，ΔH.₁= 3.7 kcal / mol，k_一种12 = 2.3-10⁵m^-1，ΔH.₁₂= 5.3千卡每摩尔。第三次滴定配体2(未显示)提供以下参数:K_一种, 2 = 2.7×10⁵m^-1，ΔH.₂= -2.1千卡每摩尔。因为Eq. 15不成立，配体1和配体2的结合不是独立发生的。另一方面，以40µM作为配体1滴定过程中游离配体2的平均浓度，应用式16的值计算配体2存在时配体1的结合参数，K_一种, 12 = 7.8×10⁴m^-1和ΔH₁₂= 5.6 kcal/mol，与直接测定值有显著差异(在实验误差范围内)(即公式16未满足)。因此，可以得出配体1和配体2是协同结合的结论。由于配体1的结合亲和力随着配体2的存在而降低，结合协同性为负。由式16可估计出协同性参数:α = 0.18， Δh = 1.6 kcal/mol(即配体2与大分子结合时，配体1的结合亲和力降低了5倍，结合焓增加了1.6 kcal/mol)。

通过在pH、温度、离子强度等相同条件下进行ITC实验，并使用具有不同电离焓的缓冲液，可以评估与配体结合耦合的质子交换过程，并估计不依赖于缓冲液的结合焓和交换的净质子数。图5显示了这个实验过程。

图5。耦合到配体结合的质子交换构成配体结合相互作用的pH依赖性的分子基础。在使用具有相似PKA但不同电离焓的缓冲剂（管道2.68 kcal / mol，Mops 5.05 kcal / mops 5.05 kcal / mops 5.05 kcal /mol，咪唑8.77 kcal / mol）。因为测量的焓明显依赖于具有负斜率的缓冲液的电离焓，所以结论是，大分子 - 配体络合物的形成伴随着净取料。两个配体的斜率类似，接近1，因此，至少一个质子从复合物中释放到堆积溶液中。然而，对于双配体，缓冲型的凸抗焓显着不同：9.3kcal / mol和0.2kcal / mol。根据当量的情况，在pH 7附近（至少|锥形<2）附近。13 pH的增加/降低将导致对两个配体的结合亲和力增加/降低;特别地，在pH中的1个单元的变化将增加/将平衡关联常数增加10倍，大约。

图6显示了特定的结合作用的热力学结合剖面的温度依赖关系，假设一个恒定的结合热容。

图6。热力学结合曲线的温度依赖性与以下结合参数的大分子 - 配体相互作用：k_一种= 10⁶m^-1， AG = -8.2千卡/mol， ΔH = -4千卡/mol, tas = -4.2千卡/mol, ACP = -0.3千卡/mol。ΔH的斜率等于ACP，而- tas的斜率为-(ACP+AS);由于通常ACP比AS大得多(在实验温度范围内)，所以焓和熵贡献的斜率非常相似，导致结合的吉布斯能对温度不敏感。因此，可以观察到平衡缔合常数随温度的变化很小，再加上通常的实验不确定性，使得通过范霍夫关系估计束缚焓变得非常具有挑战性。结合焓在温度TH(在这种情况下，接近12°C)为零，根据范霍夫关系，这是最大平衡结合常数的温度。熵的贡献在温度TS(在这种情况下，接近39°C)为零，这是最大的结合吉布斯能的温度。

结论

ITC是一个强大的工具来描述相互作用，特别是生物分子在广泛的结合亲和力的相互作用。创新科技署的不同领域和申请如下:

• 蛋白质调节与功能
• 蛋白质工程与功能再设计
• 药理/生物技术目标的表征
• 药物发现中的铅选择
• 药物开发中的铅优化
• 加强治疗用药物载体的研制
• 临床前检测(如血浆蛋白结合，通过不需要的靶点产生的潜在副作用)
• 蛋白质相互作用计算模型发展和改进的实验基准
• 在制药，化妆品，食品，清洁和生物技术行业的蛋白质/生物制剂生产的质量控制。

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