蛋白质质量控制在表面等离子体共振干涉法和生物层筛选研究

高通量筛选和确认候选人biotherapeutics可以通过执行通用的和常用的方法如表面等离子体共振(SPR)和生物层干涉法(BLI)。高通量SPR涉及识别分子固定在芯片上的关键目标。然而,劳保局允许固定目标或候选人的光纤探针,然后把手伸进microwells解决方案的反对分子。结果,一个或多个候选治疗分子与快速等有益的属性绑定动力学和高亲和力可以选择从一个屏幕。

测试候选人Biotherapeutics

数十数百名候选人biotherapeutics可以测试在典型的屏幕。出于这个原因,一些高通量SPR的仪器被设计用来画样本标准microwell板块之前将它们注入微流体通道。固定化的分析物是允许流目标分子存在优秀的候选人在芯片表面与目标抗原决定基通过特定的协会。BLI还包括类似的过程,除了不涉及微流体。然后生成一个信号成正比增加通过一个光学探针在表面束缚。这些信号的分析,对多个分析物的浓度,提供亲和力和动力学。

样品质量是阻碍有效候选人选择的参数之一。两种方法的测量是严重影响分子的纯度和解决方案属性用于SPR和BLI筛选。这些都是:1)数据质量,2)微流控的完整性。

然而,有一个通用的工具,容易解决了样本质量分析。质量是衡量高通量的蛋白质动态光散射(HT-DLS)怀亚特DynaPro板读者二世没有令人不安的解决方案(图1)。测量在同一microwell板块进行高通量筛选发现使用的平台。此外,DLS还可以确定被分析物的扩散系数。

图1所示。DynaPro板读者II评估解决方案质量标准96,384或1536孔板,不干扰样品。

分析物质量的重要性我:杂质

分析物的质量,往往被忽视,这有助于实现精确的测量是一个关键参数,从而选择合适的候选人,因此治疗提供准确的结果。低分子量杂质,包括可榨出的和可滤取的,通常有一个低对SPR和BLI测量的影响。大的杂质,如聚合和外国粒子可以,但是,影响测量的技术。欧洲杯猜球平台

信号峰值大约在纳米颗粒的质量比例或聚合生成粒子经过的距离几百纳米的芯片表面或光纤探针。

大量更小的纳米粒子的存在和聚集在一个低质量的样品,源源不断的小信号产生波动,导致退化的光学响应。欧洲杯猜球平台图2显示了模拟sensorgrams的效果。

图2。Sensorgram获得聚合分析物的存在(模拟)。

分析物总量可能是也可能不是活跃。如果活性聚合存在大量(例如,> 5%的总分析物蛋白质质量),他们结合固定化配体和产生SPR BLI信号,这是比预期的单体的交互。

不活跃的分析物总量,有效浓度将低于测量总浓度,导致减少了绑定,和亲和力的明显减少。骨料可以,无论哪种方式,导致候选绑定属性的量化不当(图3)。

图3。聚集在几个方面可能会影响SPR和BLI测量。

分析物质量的重要性我:Self-Associating分析物

标准的要求SPR和BLI分析是分析物需要在溶液中单体的浓度用于实验。不可逆转的极端影响聚合材料在分析解决在前一节中。

制定不良或“粘性”分析物可以self-associate可逆和不可逆。在这种情况下,分析物单体在动态平衡与小的寡聚物,包括二聚体或四聚体,而实际的单体浓度与蛋白质浓度不同。

的活动和表现结合位点影响最终测量的影响。活性低聚物会导致高估的亲和力,和不活跃的骨料可以产生低估(图4)。此外,表示多个结合位点可能导致活动性的影响和严重高估了亲和力。

图4。分析物与K self-association_d= 100海里可以从预期的转变明显analyte-ligand平衡等温线曲线(实线)测量曲线(虚线)。在这个分析二聚体被认为是不活跃的。

底物蛋白质品质的重要性

大部分的聚合分析物可引起实验误差,如聚合固定化蛋白质。存在的蛋白质芯片和光纤探针表面聚合尤其会导致活性物质减少或减少暴露抗原表位的平均数量/固定化质量。结果,明显的亲和力可以减少聚合基质蛋白。

排水宣传员

极其聚合,或不洁净的,材料携带大颗粒会导致另一种效应即堵塞在多通道SPR微流体。这些流体通道狭窄但长,容易堵塞,凝聚nanocrud蛋白质或其他。蛋白表达的影响,净化和准备可以受到阻塞事件的发生在一个屏幕中数十个或数百个候选人。

插入微流体芯片可以被简单地取代恢复或通过使用冗长的系统的清洁和维护。损害赔偿,如果有的话,可能导致数千美元。

应用动态光散射

动态光散射(DLS)是一种非侵入性、nonperturbative光学方法测量纳米颗粒大小分布在解决方案/暂停,从小于1纳米到几个微米。DLS基于布朗运动的原则来确定粒子的扩散率的解决方案。欧洲杯猜球平台

动力学^®软件是用于转换成粒度分布的信息。然后评估来确定粒度分布SPR微流体可以安全地注入的解决方案,如果SPR或BLI测量会产生可靠的结果。

整个过程可以快速开展过加载到设备的交互。装运是由microwell板放置到DynaPro HT-DLS系统,运行样例屏幕,和同一microwell板转移到SPR BLI乐器。

因为布朗运动,分子和纳米粒子在溶液或悬浮液抖动。欧洲杯猜球平台在不同阶段,光波分散的纳米粒子探测器。欧洲杯猜球平台结果,他们增强干涉或狼狈地探测器基于特定的存在他们之间相位差(图5)。

图6显示了扩散系数粒子大小的变换通过Stokes-Einstein方程:R_h= k_BT / 6πηd_t,k_B玻尔兹曼常数,R_h粒子的水力半径,η溶剂粘度,和T的绝对温度。

图5。随着分子通过布朗运动,每个分子的光散射横穿一条不同的道路。这导致建设性或破坏性的干涉光散射检测器。当散射波干扰建设性、DLS探测器记录光强度高;相反当波干涉相消,探测器记录低光强度。

图6。自相关分析是数学变换将光强波动扩散系数。自相关后,动态转换的扩散系数大小。

三种典型%强度大小分布由DLS如图7所示。红色和蓝色曲线是由于monomodal BSA的数量(R_h= 4)和聚苯乙烯微球的半径50 nm,分别。绿色曲线是由于单体的解决方案包含大量蛋白质,R_h∼4海里,一些大型聚合与R_h约50 nm。

图7。代表由DLS大小分布。

评估使用HT-DLS

传统,DLS microcuvette手动执行,一次一个样本。不是所有的数以百计的候选人能以这种方式的筛选。DynaPro板读者II,然而,反映了HT-DLS进行质量评估的能力为目标,所有的候选人。这是由于其基于microwell-plate格式与原位non-perturbative测量。

DynaPro避免潜在的局限性井之间的延滞的样本。测量所花费的时间可以改变每口井的10和30年代之间,包括井之间的过渡时间。

动态,在HTS-DLS应用程序中,使用时配置的数据作为一个热图取决于贫穷,中间值和高质量的大小分布对本定义指定的用户。例如,样本与一个单一的、狭窄的峰值,分析物的大小相关,可分为高质量和允许进一步绑定测定高信心(图8,红色威尔斯)。

相邻的样本显示扩大单体的峰值,表明一些低聚物和低水平的额外的微粒,可分为中间质量和允许移动,但与一个警告标志的信心的结果(图8,蓝色威尔斯)。

样品的颗粒含量micron-size范围可以被污染或容易聚合(图8,黑井)。

图8。可视化的蛋白质质量通过热图动力学。总96口井数据采集时间< 45分钟。数据由萨宾疫苗研究所和德克萨斯州贝勒医学院儿童医院中心。

额外的好处DLS

还有一个额外的好处,DLS本质上决定有助于评估传质扩散系数的影响。DynaPro板读者II的另一个特色是内置的,高倍率镜头,在拍摄每个后DLS测量。

这些图像,存储和显示与DLS相关数据,作为诊断尤其有效。图9显示了额外的例子的可怜的相机图像识别的数据来源。最后,同一microwell板用于DynaPro可能被转移到一个光谱板读者额外确认的内容和质量。

图9。DynaPro的车载摄像头帮助识别井含清洁解决方案和那些样品沉淀或预计会提供数据质量不佳。

灵敏度

每个技术和仪器都有担忧与敏感性有关。DynaPro有检测下限为0.125毫克/毫升溶菌酶(M = 14.4 kda)。灵敏度是成反比的光散射强度的摩尔质量大分子摩尔质量有关。这一趋势也可以观察到对骨料。

即使主样本浓度在探测范围内,DLS可用于质量评估由于其出色的灵敏度nanocrud的内容——亚微米颗粒和大蛋白总量绑定和微流控分析系统是有害的。

结论

本文得出结论,与潜在的候选分子可以选择最佳的治疗效果和患者利益对可靠的目标绑定屏幕,进行SPR或BLI。

提供的高通量动态光散射DynaPro板读者II可以应用于筛选工作流程解决方案分类高质量提供最大的信心交互分析,中间需要谨慎的质量测量,和低质量不适合分析,和潜在的污染测量设备。

添加HT-DLS筛选可以避免不确定性和生产力损失变量相关配体质量。这会导致可靠的绑定数据和信心的选择最终候选人。

参考

改编自“SPR和BLI大规模筛选蛋白质质量控制研究”由怀亚特技术白皮书。图表和插图从怀亚特技术允许转载。

这些信息已经采购,审核并改编自怀亚特提供的材料技术。欧洲杯足球竞彩

在这个来源的更多信息,请访问怀亚特科技。