为了制造有效的生物制药制剂，制造商需要彻底了解样品聚集的趋势。
聚合没有在生物药物作为首选：
- 聚集会降低样品中的活性成分含量，导致功效降低
- 聚集触发体内的免疫原性反应。
免疫原性反应的触发导致药物的快速清除，导致一些患者的疗效降低甚至严重的免疫反应。因此，需要对蛋白质药物样品进行表征，以开发有效的配方，并对最终产品进行表征。这就需要一种测量、鉴定和表征各种蛋白质聚合组分的方法。
传统上，这些信息是通过尺寸排除色谱(SEC)技术获得的，其中样品成分的识别是基于分子量的。通过使用尺寸排除柱，比较分析物分子的保留体积与一系列已知分子量的标准物。
通过使用浓度检测器和已知相关消光系数记录洗脱，可以从各自的峰面积获得各组分的相对比例。
尽管广泛使用的列校准SEC技术对于表征蛋白质，基于此技术的分子量评估有其局限性。这种方法的一些问题是：由于形状依赖性洗脱，分析不准确。
本文介绍了用于表征两种抗体样品的柱校准和多检测秒的使用。
这里提供了这些方法的结果和多种检测秒的能力的演示，该方法是在此提供了分辨率和粘度计和光散射检测器的揭示能力的分辨能力的组合。
而一个柱校准系统能够提供仅相对测量的在多检测SEC系统的光散射检测器量化的绝对分子量。与所分析的蛋白质的分子结构的信息被提供有差示粘度计。的蛋白质混合物的分析下一个更全面的表征可基于由所述多检测SEC方法提供的高度准确的数据来实现。
欧洲杯足球竞彩材料和方法
蛋白质分子量标记试剂盒在最终浓度为约1-3mg / mL和六个球状蛋白的最终浓度下含有在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备的排除标记。在PBS的终浓度为2-3mg / ml的PBS中也制备来自不同来源的两种多克隆免疫球蛋白G样品（IgG）。
使用厚度为0.2µm的醋酸纤维素膜过滤样品，然后向由两个Viscotek P3000柱组成的尺寸排除柱组中应用三次100µL重复进样。为实现样品的体积经济输送，选择了零浪费模式。OMNISEC系统用于以下条件下的测量：
- 流速–1毫升/分钟
- 流动相 - 磷酸盐缓冲盐水
- 25°C时的柱隔室
- 探测器盒25°C
结果和讨论
IgG色谱图：紫外吸收
这个紫外（UV）吸收检测器用于监测IgG样品的洗脱曲线（图1）。
样品和在它们的相对组合物中的边际差异检测的定性比较是通过重叠两个色谱实现。
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图1。人IgG（红色）和羊IgG（紫色）的代表性紫外色谱图叠加。
与保留体积甲显著峰（VR）在大约16.0毫升，和许多种类的在较低的保留体积存在下从两个样品的色谱观察到。使用尺寸排阻理论上它可以得出结论，从主峰上游峰是由于具有越来越大的流体动力学半径，这可能主要是IgG单体的聚集体物种。所述小峰呈现主峰的下游（具有近似VR24mL）中的，由小流体动力学半径引起的，最有可能的盐的分子。
通过SEC柱校准的IgG样品的表征
通过绘制每种蛋白质的分子量（logmw）的对数作为蛋白质保留体积与柱空隙体积（Vo）的函数来进行表征。为了估计两个样品色谱图中出现的峰的分子量值，校准参数由数据的线性拟合得出(图2）。
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图2。SEC列校准曲线绵羊（横跨）和人（钻石）IgG数据叠加。
由检测到的所估计的分子量值和其他定量属性列校准列于表1。
表格1。SEC列校准结果摘要。
|
人类免疫球蛋白 |
绵羊IgG. |
| 峰1 |
峰2 |
峰3 |
峰4 |
峰1 |
峰2 |
峰3 |
| vR（ml） |
> 13.00 |
13.80 |
14.69 |
16.51 |
>13.80 |
14.60 |
16.44 |
| 兆瓦(kDa) |
- |
627.2 |
398.9 |
158.1. |
- |
417.6 |
163.8 |
| 身份 |
更高
命令
总计的 |
三聚体 |
N / d |
单体 |
更高
命令
总计的 |
N / d |
单体 |
在150kDa区域中，抗体单体表现出标称分子量。可以从列校准数据中观察到用于人类的峰值3的预测的MW，以及用于绵羊的峰值2，大多数可能涉及单体物种。然而，这些峰值分别在158.1和163.8kDA下略微高于标称分子量。此外，在较低的保留体积下，用于绵羊14.60mL的峰值1和用于人体14.69ml的峰2，不对应于二聚体或三聚体质量，这不支持确定的鉴定。另外，用于人类的峰1的估计分子量可以与632.4kDa的四聚体质量相关。
IgG样品通过色谱表征耦合的多检测
在该分析中，使用多检测器SEC分析相同的样品组（IgG），表2中列出了人和羊IgG样品的相应定量性质。
表2。多探测器SEC的结果摘要。
|
人类免疫球蛋白 |
绵羊IgG. |
| 峰1 |
峰2 |
峰3 |
峰4 |
峰1 |
峰2 |
峰3 |
| 兆瓦(kDa) |
722.8 |
459.0 |
299.5 |
147.5 |
551.7 |
306.7 |
152 |
| 兆瓦/锰 |
1.0334 |
1.0008. |
1.0002 |
1.0002 |
1.0697 |
1.0010 |
1.0002 |
| RH（NM） |
11.0 |
8．2 |
6.7 |
4.8 |
8.8 |
6.8 |
5.0 |
| IV（分升/克） |
0.159 |
0.086 |
0.068 |
0.049 |
0.097 |
0.064 |
0.051 |
| 身份 |
更高
命令
总计的 |
三聚体 |
迪慕默 |
单体 |
更高
命令
总计的 |
迪慕默 |
单体 |
| %构图 |
1.3 |
2.4 |
11．4 |
84.9 |
2.8 |
11.6 |
85.6 |
据观察，绝对值MW值对于人IgG峰值1-3对应于三聚体，二聚体和单体物质的预期值，并且对于IgG峰1,2获得的各个MW值与二聚体和单体物种同步。粘度计提供了用于测量IgG单体的流体动力学半径的附加信息，并比较这些值。
在比较的基础上，对两种分子的洗脱顺序进行了合理化分析，发现IgG(人)单体比IgG(羊)单体更小(Rh= 4.8 nm)，洗脱时间略晚。位于二聚体和三聚体峰上游的点(RV<14.0 mL)产生的信号对应的分子分子量越来越高，这很可能是更高阶聚集的结果(图3)。
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图3。多探测器SEC色谱图的人和绵羊IgG样品 - 折射率（红色），直角光散射（绿色），低角度光散射（黑色），粘度计（蓝色），紫外线（紫色）。物种的分子量在橄榄中显示。
这些分子的相对高的多分散性(Mw/Mn)在人类和绵羊混合物中分别为1.0334和1.0697，重申了上述观察。从上述观察可以看出，两种IgG样品的聚合体组成存在明显差异。此外，在人类而非绵羊样本中观察到大量三聚体群体的存在，这表明在绵羊样本聚集的路径或稳定性方面存在差异，需要进一步研究。
在柱校正SEC形状依赖不准确
根据柱校准和校准获得的数据多探测器秒分析，可以看出，从前者的Mw值均高于后者。对应于与该单体中既分析帮助识别单体种类的峰的Mw值。在聚集体的峰，如二聚物的情况下，准确的鉴定是Mw为因为值从28％的预期值的偏差是不可能的。
柱校准方法中的此类误差可能是由于形状对抗体分子及其聚集物通过柱基质洗脱的影响。然而，多重检测方法没有这种错误。
根据尺寸排除理论，蛋白质分子的柱渗透属性取决于流体动力体积。由于流体动力体积对结构和质量的依赖性，具有特定分子量的蛋白质的流体动力值可能等于或小于具有较低分子量的蛋白质的流体动力值。这是因为后者的密度较低，结构较长。
实际上，这些具有不同形状的分子所构建的校准曲线的斜率也会不同。实施柱校准中使用球状蛋白质的标准方法意味着假设样品上也存在球状。然而，由于抗体具有Y形结构而非球形结构，使用标准方法会导致分子大小增加时的高估和不准确的分子量值。
结论
列校准和多检测器的SEC方法的性能是通过分析两种不同的IgG样品进行比较。该SEC方法的分析结果结论性地允许指定离散的峰到特定寡聚状态，并且帮助区分和量化在两个样本之间的聚集状态的变化。根据分析数据，生物制药生产商都能够识别和各种条件下或在配方理解各候选人的行为属性。生产和这种制剂的功效的理解，并且控制可以基于上述结果得到改善。
马尔文PANalytical公司的OmniSEC系统是使用其中甚至几微克或较少量的样品的能够测量一个高度敏感的系统。该系统是在处理样品，因为自动进样器消除浪费样品非常经济。此外，将样品保持在测量前凉爽的温度，由此，防止在等待时间期间的聚集。鉴于使用的OmniSEC系统的上述好处，它被认为是蛋白质和生物制药的精确表征一个宝贵的系统。
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此信息已经来源，审议通过马尔文PANALYTICAL提供的材料改编。欧洲杯足球竞彩
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