利用UHP-SEC-MALS进行高速过程监控

在线过程监测(ALPM)是超高阻垢色谱(UHP-SEC)的主要应用。生物药物的ALPM有助于减少与过程分析相关的时间和精力。

虽然标准高效液相色谱(HPLC)具有良好的分析能力，但在ALPM中应用过于缓慢。与传统的高效液相色谱相比，超高效液相色谱(UHPLC)提供了更好的分辨率，并大大缩短了分析时间。这使得在在线、工艺条件和快速稳定性测试期间测量碎片和聚合样品成为可行的。

本文探讨了UHP-SEC-MALS与内联动态光散射（DLS）如何进行多角度光散射（马尔斯）和UHPC尺寸排阻色谱法（UHP-SEC），可作为一种有效工具，用于在加工和快速稳定条件下鉴定生产线上遇到的单克隆抗体和降解物/杂质。

UHPLC检测器UT rEX和µDAWN可确定单个洗脱物种的分子大小和绝对溶液分子量。尽管如此，UHP-SEC-MALS实验只需几分钟，使该方法适用于过程监控。

两种抗体-单克隆抗体1（mAb₁)和单克隆抗体2 (mAb₂)-在本分析中，使用UHP-SEC-MALS模拟不同条件下的高速过程监控可能被证明是合适的。单克隆抗体₁抗体代表从纯化过程中获得的几个部分。

峰值的摩尔质量由MALS确定，有助于检测每个物种。最终结果表明，UHP-SEC-MALS可用于常规的过程中监测。

单克隆抗体₂抗体是一种正在进行稳定性测试的分子。几种具有稳定性条件的配方可导致无数样本被表征。

与传统的HPLC-SEC-MALS相比，UHP-SEC-MALS分析的吞吐量增加了，能够表征片段、聚集物和其他降解物。据观察，根据这些物种的量化摩尔质量，与条件1和条件2相反，条件3可以产生不同的碎片。

该样品强调了在UHP-SEC中检测MALS的必要性，因为这两种稳定性条件导致单体具有不同的洗脱时间，但摩尔质量相似，如MALS方法所确定的。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

UHP-SEC采用BEH SEC色谱柱(200Å， 1.7µm, 4.6 mm x 150 mm)、自动进样器和Acquity UPLC泵(Waters Corporation)进行。

允许SEC柱的废水通过Waters的内联紫外/可见检测器Optilab UT rEX dRI检测器，以及怀亚特曙光多角度光散射探测器配备内部WyattQELS动态光散射探测器。

采用磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为流动相，流速为0.5ml/min。对于每个色谱图，给药2-5µL样品，每个样品运行5分钟。

随后，怀亚特的ASTRA软件被用于数据收集和分析。表1列出了所有样本。

马伯₁表示纯化处理步骤的多个阶段，以纯化样品结束。单克隆抗体₂进行了许多稳定性测试程序。使用牛血清白蛋白（BSA）表明，数据质量或分辨率不会随着流速的变化而降低。

表1。抗体的样品

样品	描述
马伯1	纯化抗体1
马伯1-C1	mAb 1，工艺条件1
马伯1-C2	mAb 1，工艺条件2
马伯2-C1	单抗2，稳定性条件1
马伯2-C2	单抗2，稳定性条件2
马伯2-C3.	单抗2，稳定性条件3

结果和讨论

没有因流速而丧失分辨率

比较了不同流速下牛血清白蛋白的摩尔质量分布、峰分辨率和测量质量。如图1所示，当分离浓度为0.5 mL/min而不是0.3 L/min时，峰的分辨率和形状没有明显变化。

还观察到三聚体、二聚体和单体的定量摩尔质量一致，总洗脱质量和单个物种的洗脱质量在两种流速下保持相同（表2）。

图1所示。0.3mL/min（蓝色）和0.5mL/min（红色）下分离BSA的光散射色谱图。通过MALS测得的摩尔质量与每个色谱图重叠。

表2。在图1第2页所示的两种流速下，每种物质的质量分数

	0.3毫升/分钟	0.5毫升/分钟
单体	86.4%	85.5%
二聚体	8.2%	8.1%
三聚物	1.4%	1.6%

单抗的过程监控₁净化

一旦确定摩尔质量精度和分辨率不随流速变化，就使用高速UHP-SEC-MALS测量单抗分离相₁净化。大约70%的单体存在于起始材料mAb中₁-C₁，剩余的质量由碎片和聚集种表示。

单克隆抗体₁-C₂样品表明是一个中间净化过程，结果是85%的单体溶液。最终纯化的抗体- mAb₁-大于95%的单体质量。

UHP-SEC-MALS方法能够快速定量所有mAb样品，使其适用于ALPM。整个物种在三分钟内洗脱，如图2所示，在大约4分钟的洗脱时间，可以在RI数据中看到溶剂峰。

这使得在5分钟内完成一个完整的UHP-SECMALS实验成为可能。UHP-SEC-MALS方法快速可靠。个别样品重复注射的色谱图如图2和图3所示。

图2。mAb的光散射色谱图叠加₁经历不同的净化阶段

图3。单抗折射率的浓度数据₁经历不同的净化阶段。测量的摩尔质量被覆盖在每个峰上。色谱图如图2所示。

光散射数据(图2)和通过折射率量化的浓度(图3)对每个重复精确叠加。洗脱物的同一性可以通过摩尔质量来确定。

尽管特定峰的浓度较低，但用μ DAWN和UT-rEX检测器定量的摩尔质量是强的和一致的。

例如，关于纯化的单克隆抗体₁（由图2和图3中的蓝线表示），尽管从柱中洗脱时最高聚集浓度仅为0.8µg/mL，但发现定量摩尔质量在条件1和条件2测定的摩尔质量的2%范围内，其中洗脱浓度高得多（峰值2Mw，图4）。

图4。每个物种的峰值定义（顶部）和产生的摩尔质量和质量分数（底部）。对每个单克隆抗体进行两次注射₁样本。如上图所示，所有六种注射在相同的洗脱时间内确定了峰面积(mAb₁-C₁）.各峰的重量平均摩尔质量和质量分数列于表中。图对应光散射(红色)，RI(蓝色)和UV(绿色)信号。

根据单克隆抗体定义了五种不同的物种₁-C1色谱图。图4显示了这些物种的峰值定义。

结合单个峰的RI信号测量物种的质量分数。如图4所示的表格显示了对不同骨料馏分的有效去除，随着提纯过程的进行，单体逐渐富集。

在收集的分数中，物种的摩尔质量似乎也是恒定的，如图3和图4所示。摩尔质量数据提供了关于单个团聚体或净化过程的性质的关键信息，如是否形成了新的团聚体物种或团聚体在净化过程中是否被剪切。

单克隆抗体的稳定性试验₂

除了提纯外，ALPM在加速稳定性试验中也是首选，该试验用于改进配方。稳定性测试可能会产生无数的样品，而快速准确地测量这些样品是非常重要的。

mAb经历了三种稳定性测试条件₂样本。对于每个条件，碎片、单体和二聚体的质量分数和摩尔质量使用与单抗相同的色谱条件进行测定₁样本。

所有三个稳定条件导致不同的片段，单体和二聚体的轮廓。条件1和2得到了相似的色谱图，但是单抗₂-C₂与单克隆抗体相比，含有较高比例的二聚体₂-C₁（图5和表3）。然而，如图6和表3所示，条件3导致相对较小的二聚体，但片段的比例较大。

图5。单克隆抗体的折射率色谱图₂在稳定性条件1(蓝色)和2(红色)下。单体、二聚体和碎片峰的摩尔质量已经重叠。

表3。mAb在不同应力条件下单体、二聚体和碎片的演化₂

		单体		二聚体		碎片
		兆瓦 (kDa)	质量 (%)	兆瓦 (kDa)	质量 (%)	兆瓦 (kDa)	质量 (%)
mAb4-C1	1	152.8	87.7%	308.4	8.4%	114.4	4.0%
	2	152.4	87.5%	305.4	8.7%	111.1	3.8%
mAb4-C2	1	151.5	87.1%	306.6	9.3%	112.9	3.7%
	2	151.4	87.2%	303.1	9.2%	114.0	3.7%
mAb4-C3	1	153.0	90.2%	286.7	1.2%	132.1	8.6%
	2	152.7	90.2%	285.1	1.5%	130.2	8.3%

图6。单克隆抗体的折射率色谱图₂稳定性条件3(紫色)。摩尔质量值从MALS的单体，二聚体，和碎片峰已被覆盖。用色谱法测定了单抗的摩尔质量₂-C₂（红色）用于比较。

稳定性条件3强调了以下要求：mal与条件1和2（图6）相比，SEC有两种不同的变化。条件3的单体洗脱时间与条件1和2的相同，但该峰的定量摩尔质量保持不变（表3）。

如果仅考虑洗脱时间，则可以得出抗体已降解的结论，但通过测量所有三种条件下的类似摩尔质量，可以假设延迟洗脱时间可能是构象变化的结果，例如部分展开或柱相互作用。例如，在稳定性试验过程中暴露的疏水性贴片和其他残留物。

碎片的摩尔质量比条件1和条件2高得多。这可能是由于与单体的共溶，或者可能表明与条件1和条件2相比，这种稳定性条件产生了不寻常的碎片模式。

除了MALS法得到的摩尔质量外，用DLS法还可以测量流体力学半径。三种单体的流体力学半径均为Rh = 5.1±0.1 nm(图7)₂-C_3.与mAb相比，没有明显展开₂-C₂和马伯₂-C₁，晚洗脱时间可能是柱间相互作用的结果。

图7。mAb流体动力半径测量数据₂在光散射色谱图上覆盖稳定性试验1（蓝色）、2（红色）和3（紫色）的单体。

结论

本文描述了高速UHP-SEC与DLS和MALS技术在抗体样品高速过程监测中的应用。在这种方法的帮助下，测量可以在5分钟内进行，允许观察净化和其他类似的处理步骤，除了高通量稳定筛选。

UT-rEX和µDAWN探测器能够对流体力学半径和碎片和聚集体的摩尔质量进行临界和一致的定量，否则仅用标准的UHPLC分析是无法实现的。

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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