偶联MALS和SAXS用于生物聚合物丝状网络组装的时间分辨研究:纤维蛋白形成gydF4y2Ba

生物聚合物丝状网络是生物世界的关键组成部分。一些关键的例子包括结缔组织(胶原蛋白)、细胞骨架(肌动蛋白)和凝血系统(纤维蛋白)。gydF4y2Ba

这些方法是大分子单体的聚合或组装的结果，并且可以通过组合纯组分触发的时间分辨散射方法检查。a的应用gydF4y2Ba黎明DSP malgydF4y2Ba先前显示仪器以证明酶活化后纤维蛋白原（FG）组件的早期反应阶段，恢复的时间展开gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba和< RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba合奏。gydF4y2Ba

从MALS数据中不可能恢复反应早期纤维截面的演化——纤维结构形成的关键结构参数。这种纤维横截面可以通过所谓的Casassa图法确定，但大多数反应物种类都太短(< 200 nm)，无法应用。或者，截面均方半径cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba可以从SAXS数据中恢复。gydF4y2Ba

一种实验组，含有淋巴流通毛细管电池，配备珀耳帖gydF4y2BaHELEOS-II 18角MALS探测器gydF4y2Ba，并在同步加速器SOLEIL的SWING光束处装配了一个止流混合器。MALS探测器在这一设置中起着关键作用，它有助于跟踪cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba和< RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba在纤维蛋白聚合的早期相期间。gydF4y2Ba

建模潜在的反应途径揭示了纤维蛋白组装的传统机制，涉及瞬间形成双链原纤维的单体单元的半交错组装，不足以阐明数据。gydF4y2Ba

建议修订的模型与数据完全兼容，也可以阐明纤维蛋白网络的其他方面。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba纤维蛋白原网络形成的“典型”模型。从FG分子的中心结构域酶促除去两种短肽（FPA），发现Gly-Pro-Arg（GPR）“旋钮”，其与“孔”互补地存在于每个FG分子的外部结构域中。这引发了自组装，生产长，半交错，完全双链（Proto）原纤维。通过延迟酶促除去另一对肽（FPB）来辅助侧向原纤维聚集和分支，产生最终纤维蛋白网络。gydF4y2Ba

欧洲杯足球竞彩材料和方法gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba

只使用试剂级化学品进行实验，并且对所有溶液采用MilliQ水。冻干，纤溶酶原耗尽的人FG从ERL获得。gydF4y2Ba

在20 mg/ml的条件下重组，并在实验前通过制备大小排除柱进行纯化，以大约2 mg/ml的原溶液生成大约20 ml。获得Sigma-Aldrich’s A-5042(蛇毒Ancrod激活酶)。gydF4y2Ba

制备50 NIH单位/ml等量的小瓶，并保持在-80°C。GPRP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba是巴赫姆的H-1998。gydF4y2Ba

对于所有实验，NaCl 104mm，Tris 50mm，抑肽蛋白10kiu / ml，pH 7.4（TBS），有或没有CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1.25 mM，作为缓冲液。gydF4y2Ba

仪表gydF4y2Ba

需要远程控制设备来制作SAXS束线测量。由四注射器组成的整个设置，停止流动混合器随着混频器，外部电磁阀和分离器的整合而改变。gydF4y2Ba

这种设置可防止在注射之间的长时间等待期间的交叉污染，并可在注射完成后快速冲洗外部混合器。在混合器后立即安装一个70µl PEEK/titanium 0.1µm的在线过滤器罩，以消除颗粒。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba停止流动MALS/SAXS设置示意图。显示下阀的两个位置;其他阀门组合在实验中使用(见[5])。绿色,缓冲;品红色,反应混合物。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Ba在SOLEIL的摆动梁线Huckl中的组合MALS-SAXS装置。gydF4y2Ba

反应混合物内不应受干扰gydF4y2BamalgydF4y2Ba用于时间分辨测量的单元，但在撒克毛细管中应该定期刷新。这样做是为了确保强X射线束不会对蛋白质造成任何不可逆的损伤。gydF4y2Ba

位于淋巴和MALS细胞之间的四路旋转阀，注射后不久将MALS细胞与其余的清洁剂分离，并将流量引导到撒克皂毛细管。通过每两个X射线射击的增量通过淋巴毛细管推动溶液，每个X射线射击持续约0.5秒，间隔为5秒。需要大约1.6ml来填充细胞以及累积回路。gydF4y2Ba

MALS数据采集和分析gydF4y2Ba

HeLeOS-II电池在20±0.1℃下稳定，以确保静态gydF4y2BamalgydF4y2Ba样品不会被激光大大加热。使用ASTRA 6.0.3软件，进行初始分析和数据采集。gydF4y2Ba

dn/dc值为0.192 cmgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba/g为FG和TBS, n =1。3332 λ= 651 nm, 16个散射角，在13.5°和157.5°之间。QELS光纤位于12号位置，大约100°，使用RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba对同一样品直接用SAXS测定的FG进行归一化处理。gydF4y2Ba

在同一文件中，获得了超过单一聚合运行，直接在Astra软件运行时直接注射缓冲混合物缓冲液序列。图4示出了部分处理的运行的示例。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2BaHELEOS-II从0.46 mg/ml的纤维蛋白原(FG)样品中收集角MALS数据(标准化电压)，该样品由0.05 NIH单位/mg的蛇毒酶“Ancrod”FG诱导聚合。反应在凝胶点之前停止。面板A，完整的数据集。面板B，放大后的第一个~100个。时间被重新调整到注入阶段的结束。请注意，即使在最低角度的数据质量也很好。gydF4y2Ba

Zimm形式主义被用来处理数据。由于反应产生了大量的多分散的棒状物质，Zimm图很快偏离了角线性。gydF4y2Ba

每个数据集都配备了从第1度到第5度不等的多项式，不包括并包括两个最下面的角度(图5)gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba和< RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba数据集随后被发送到ExcelgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba电子表格到物理整理部分，以获得角度依赖的最佳拟合，最终建立ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba值（gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba受特定拟合过程影响的值较小）。gydF4y2Ba

进行了更多的模拟，以确定该过程准确性提供ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba棒状粒子的多分散混合物的值。欧洲杯猜球平台gydF4y2Ba

图5。gydF4y2BaASTRA处理的数据来自图4。面板A，在混合后51秒收集的切片，强调不少于3次多项式的需要，并包括20.9°散射角。面板B，混合后445秒收集的切片，其中需要使用所有角度的5次多项式。gydF4y2Ba

SAXS数据采集和分析gydF4y2Ba

对于非聚合FG, SAXS探测器的距离为4米。经内部数据处理后，ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba使用US-SOMO SAS模块从横截面Guinier块中获取值。gydF4y2Ba

造型gydF4y2Ba

在roccoM等人中描述了使用改变的血液双官能缩聚方案的复杂纤维蛋白聚合建模的完整描述，并表示作为圆柱体的单个FG单元。2014. J.IA。化学。SOC。136,5376-5384。gydF4y2Ba

建模允许从FG分子中占用的两个FPA之间的释放比Q。由高Q值产生的分布朝向长聚合物倾斜。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

图6显示了绘制重量平均摩尔质量的数据集序列gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba，均线半径ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba，均方形厚度cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba对比在不同溶剂条件下(BS, TBS + CaCl)， Ancrod引起的FG聚合时间gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1.25 mM, TBS + GPRP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba比FG多10倍摩尔。gydF4y2Ba

图6。gydF4y2Ba偶联MALS/SAXS测量不同条件下的活化纤维蛋白原聚合:TBS，是Tris生理盐水缓冲液;TBS与CA.gydF4y2Ba^++gydF4y2Ba；TBS与GPRP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，一种竞争结合位点的肽，用于限速。反应在凝胶点之前就停止了，这在Ca之前就发生了gydF4y2Ba^++gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在时的三个条件下看到了大的变化gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba和< RgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba，而在cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba数据时，GPRP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与无GPRP-NH相比，有抑制剂存在gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相反，在通过绘制cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba(图7A)，三个数据集相互叠加，说明聚合的基本机理是相同的，尽管在时间演化上存在巨大差异。gydF4y2Ba

在cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba情节时gprp-nhgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba抑制剂以限速量存在。gydF4y2Ba

图7。gydF4y2Ba不同条件下FG聚合的均方半径与质量-平均摩尔质量(A)和均方厚度与质量-平均摩尔质量(B)图。叠加的是一些聚合模型生成的模型曲线(见正文)。gydF4y2Ba

随后进行建模以推断结果。最初，我们使用的是传统的模型。gydF4y2Ba

完全半交错的杆状双链（RLDS）刚性聚合物可以仅适用于cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba图（在图6A中指示为灰色虚线曲线）。完全半交错的蠕虫样双链（WLDS）半柔性聚合物能够适合整体cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba数据集（指示图7A中的橙色虚线曲线）。gydF4y2Ba

然而，这些模型无法拟合cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba曲线(如图7B所示灰色虚线)，表明聚合物的宽度逐渐增大，超出了传统模型的预期。gydF4y2Ba

随后，我们开发了一个新的纤维蛋白聚合模型，包括一个结合事件和一个延迟过渡到全双链(DS)纤维，如图8A所示。gydF4y2Ba

图8。gydF4y2Ba用于纤维蛋白聚合的“Y梯形到双链”（YL→DS）模型。面板A，与全DS过渡的单结合。面板B，顶部：由横轴束缚产生的分支结构生长链静止旋钮;底部：典型的所得支化纤维，仍然在Y1构型中。gydF4y2Ba

这种伸长率模式会产生聚合物，其RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba接近于它们的等效完全DS实体，并且其横截面，根据SAXS的观察，与母FG单体相同。gydF4y2Ba

此外，新模型允许分支在早期阶段生长(图8B)。通过调节DS转变和分支发生，可以建立拟合cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba以及cgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba_zgydF4y2Ba与< M >gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba(图7，黑线)。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在聚合反应的初始阶段期间，纤维蛋白网络显示棒状，细长单体的形成，然后前进到最终分支和增稠的长纤维组件。可以描述这种复杂的行为gydF4y2BaMALS测量。gydF4y2Ba

通过时间测序的MALS数据建立形状和大小相关参数的演变。最佳的角度范围与温度控制的18角度黎明仪器呈现的一致数据，形成阐明阐释这种系统所需的全面建模研究的强基础。gydF4y2Ba

同时获得的SAXS数据和通过DAWN的流胞结构获得的MALS数据对于确定原纤维分支和增厚时的侧向生长剖面非常重要。gydF4y2Ba

纤维蛋白网络形成的标准模型在聚合过程中不会促进早期分支。根据MALS-SAXS分析的强劲结果，自信地修改了这条范式。gydF4y2Ba

在新模型中，少量纤维蛋白块中的几个分支可能互连，而其他分支在新形成的网络长丝上塌陷，导致更厚但低密度的纤维。gydF4y2Ba

ASTRA软件提供了先进的能力来获取和处理gydF4y2Bamal数据,gydF4y2Ba但纤维蛋白聚合过程中形成的棒状颗粒混合物的复杂、多分散性质规定了需要进一步的数据处理。欧洲杯猜球平台因此，开发了一种手动检测多项式阶数和最优角范围的方法来研究非线性Zimm图。目前正在进行一些工作，以便在一定程度上实现这一任务的自动化。gydF4y2Ba

本文中描述的快速混合MALS / SAXS设置具有高质量的数据。分析类似反应的研究人员，在合成或生物聚合物领域创造丝状网络可以利用这种新机会，如果他们已经在其实验室使用自己的特定MALS文书已经定义了他们的系统。gydF4y2Ba

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