理解使用CG-MALS抗体和病毒糖蛋白的交互

病毒糖蛋白(虚地磁极)扮演了一个重要的部分在绑定和宿主细胞和病毒膜融合。中和抗体反应也目标虚地磁极作为他们的主要标志。

大多数表面虚地磁极低聚物的复合物的形成四聚体,三聚,或者调光器(图1)。在设计接触后抗体治疗或开发疫苗,重要的是要知道各种抗体绑定到这些复合物,如果他们与亲和力。

例如,当代埃博拉病毒的医生和科学家正在探索新的治疗目标免疫球蛋白治疗它们的有效性的鸡尾酒(命et al . 2014年)。

图1所示。病毒颗粒镶嵌着glcyoproteins的电子显微图欧洲杯猜球平台

任何明显的变化衡量摩尔质量(M_w)组成的函数量化composition-gradient多角度光散射(CG -mal)。这使可逆协会在解决方案。

化学计量学和关联不同的蛋白质协会可以评估,使用CG-MALS在一个解决方案。在这个实验中,CG-MALS用来跟踪之间的交互是中和抗体(免疫球蛋白)和二聚的病毒糖蛋白(虚地磁极)。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

试剂

创建虚地磁极通过复合昆虫细胞和亲和纯化SEC-MALS之前。免疫球蛋白是重组质粒的哺乳动物细胞产生编码轻、重链。

蛋白质亲和捕获净化免疫球蛋白。所有的测试进行pH值7.5,150毫米氯化钠(TBS)和25毫米三。

SEC-MALS和蛋白质结合分析

一个AKTA净化器FPLC OptilabT-rEX微分示差折光检测器和兼容miniDAWN心心mal探测器,和一个售价10/30列(通用电气医疗集团)被用来进行SEC-MALS实验。

阿斯特拉软件被用于数据的收集和分析。ASTRA的蛋白质共轭分析来评估一个纠正消光系数和dn /直流确定多糖含量,并确定虚地磁极蛋白质比例。

平衡常数的测定

海中女神II成分梯度系统用于CG-MALS测试生产各种成分的糖蛋白,抗体,和缓冲区,并将其发送给在线紫外检测器(GE)和miniDAWN心心。过滤缓冲和示例,聚碳酸酯(微孔)过滤膜,孔径为0.1µM,融入海中女神。

免疫球蛋白和虚地磁极淡化了TBS 50µg /毫升的浓度。Anotop(绘画纸)注射器过滤器用来过滤所有解决方案0.02µM,然后加载到海中女神II。

自我评估协会和虚地磁极hetero-associations,自动海中女神技术使用单个组件梯度和双重部件的“跨界”梯度,分别。

为了准备的各种成分,0.7毫升的蛋白质的解决方案是实施mal和紫外探测器。然后他们被mal流细胞内达到平衡。

GP hetero-association梯度、流停止一段300秒,而对于self-association流停止了60秒。海中女神软件用于收集和分析数据。

消光系数和dn /直流通过共轭的SEC-MALS被用来分析CG-MALS数据。

结果与讨论

糖蛋白表征

的平均分子量低聚物的状态和糖蛋白进行评估通过检查使用SEC-MALS虚地磁极,之前被CG-MALS检查。蛋白质共轭分析可以进行评估虚地磁极的多糖含量通过合并国际扶轮和紫外线浓度信号。

多糖含量在注射由图2所示~虚地磁极总质量的17%。纠正了消光系数和dn /直流值获得进一步CG-MALS研究通过这个描述。

图2。与蛋白质的共轭分析400µl SEC-MALS数据(红色)和100年µl虚地磁极注射(蓝色)。当400µl样本运行在列,计算虚地磁极118 kDa的议员(蛋白质含量82.5%),对应于一个二聚体。当100年µl相同的浓度是运行在列,计算虚地磁极104 kDa的议员(蛋白质含量83%),表明快速动力学的二聚体形式

衡量发作,摩尔增加注入体积的函数或洗脱浓度。这表明一个平衡协会,如图2所示,快速动力学。

对于这个实验,apex分子量(MP) 400年注射µL 118 kDa的洗脱浓度199µg /毫升和100年注射µL 104 kDa的洗脱浓度66µg /毫升(图3)。预测单体质量的虚地磁极47 kDa。

~ 10 kDa,添加为多糖的质量,是一个9潜在糖基化网站的结果。因此,糖蛋白的分子质量测量使用SEC-MALS匹配本地二聚体。

分子质量的增加浓度的结果可能表明一个平衡协会的二聚体种类的高阶。

图3。虚地磁极衡量摩尔质量的增加浓度的函数CG-MALS实验,表明平衡self-association,同意SEC-MALS数据

摩尔质量浓度增加一个类似的发现在虚地磁极CG-MALS测试。从94 kDa摩尔质量增加到106 kDa观察一个物种为虚地磁极浓度梯度,由5个不同浓度从9.4µg /毫升47µg /毫升。

这表明虚地磁极本地二聚物在实验条件与极少量的四聚物(二聚体,二聚体)。然而,随着物种的贡献是如此无足轻重,GP样本标记为一个本地,non-associating二聚体而不是完美的适合模型中所使用的术语,

平衡免疫球蛋白和虚地磁极协会

为了探索潜在的相互作用,发生在溶液anti-vGP单克隆抗体(免疫球蛋白)和虚地磁极,自动化的海中女神技术计算多个蛋白质成分。

光散射和浓度测量在17个免疫球蛋白和hetero-association虚地磁极浓度水平,5点虚地磁极浓度水平self-association合并的数据。

M_w来自SEC-MALS(图2)是在良好的协议与虚地磁极,这被认为是一个本地二聚体与测量100 kDa的摩尔质量。144.84 kDa的分子量质量与抗体的摩尔质量,评估145 kDa。

时的交叉梯度,融合虚地磁极免疫球蛋白是明显的量化衡量摩尔质量(M_w)。

增加的衡量摩尔质量(M_w)匹配观察复杂的形成。人口的增加_w被发现的两倍多万_w对,没有相互作用的蛋白质。这是由图4中的灰色虚线表示。

图4。衡量每个成分的摩尔质量hetero-association梯度。免疫球蛋白的形成:虚地磁极复合物导致测量摩尔质量的增加。最适合(红线)需要比简单高阶协会(免疫球蛋白)(GP)和(免疫球蛋白)(GP) 2,显示“1:n”曲线(绿色虚线)。医生指的是二聚体的摩尔浓度的浓度。

浓度、光散射强度数据探索了化学计量学评价和亲和力之间的交互免疫球蛋白和虚地磁极(图5(左)。一个关联模型最佳描述数据包括以下:

1. 两个vGP-binding网站对于每个抗体分子,1或2虚地磁极二聚体可以连接到每个抗体与平等的亲和力
2. 一个高阶复杂组成的两个虚地磁极二聚体两种抗体。

最重要的是,有一个关联模型,引入了一个任期为两个相等的抗体结合网站为每个虚地磁极不符合数据的二聚体。这表明一个免疫球蛋白分子可能阻止绑定由于空间障碍,和抗体抗原决定基可能在或接近二聚的接口。

一个模型,忽略了高阶复合物# 2中提到的不符合数据,作为绿色虚线图4所示。这表明可能有少量的高阶低聚物,(大部分的二聚体,二聚体)的多个抗体可以绑定。

平衡协会常数虚地磁极之间的相互作用和免疫球蛋白来自下面列出了最适合。

这些常数K匹配_D= 58纳米单绑定关联。(免疫球蛋白)₂(医生)₂相互作用的平衡缔合常数测量K_2、2= 1.63 x 10²¹米^{- 3}。这个值与平均单K的亲和力_D= 85海里。

计算K_一个和分子量是用来评估解决方案中的每个物种的浓度水平时交叉梯度(图5中,右)。两个(免疫球蛋白)₂(虚地磁极)₂(免疫球蛋白)(虚地磁极)物种达到最高浓度时的总浓度即免疫球蛋白和虚地磁极二聚体都平等。[虚地磁极]_总=(免疫球蛋白)_总= 209海里。

虽然两物种达到峰值相同的虚地磁极成分和免疫球蛋白,(免疫球蛋白)(GP)的数量超过6倍的数量(免疫球蛋白)₂(医生)₂(图5)。(免疫球蛋白)的最高浓度(虚地磁极)₂(虚地磁极)时达到_总= 2(免疫球蛋白)_总= 290海里。

图5。最适合CG-MALS数据(左)和每个物种(右)的摩尔分数。左:CG-MALS hetero-association数据是最适合的模型在每个工厂免疫球蛋白绑定到虚地磁极二聚体与亲和力。最适合的()测量)λlight散射数据()是由贡献之和自由单体的免疫球蛋白,免费虚地磁极二聚体,免疫球蛋白绑定到一个或两个虚地磁极二聚体(“1:n”),和两个免疫球蛋白分子的高阶复杂绑定到两个虚地磁极二聚体。右:光散射数据转换为每个复杂的摩尔浓度。飘散的免疫球蛋白g单体的比例和虚地磁极二聚体已经离开了清晰度。

结论

结合微分折射率检测分析和多角度光散射与凝胶排阻层析法使研究人员评估,毫无疑问,蛋白质成分重量,多糖重组病毒糖蛋白表达的内容,和总分子量。这种方法还允许他们证明单独的虚地磁极锻造高阶关联快速动力学。

每一个物种的解决方案使用CG-MALS抗体和虚地磁极量化。正如前面观察到在IgG-antigen多次交互,研究人员预期的一个免疫球蛋白分子附着两个医生二聚体具有相同的亲和力。

他们很惊讶当结果却并不如他们所期望的那样。绑定两个免疫球蛋白分子,由一个虚地磁极二聚体,并没有同时发生。

研究人员能够更好地理解这种抗体和抗原之间的相互作用比之前的更详细的方式,使用CG-MALS。除了提供重要信息的亲和力有关所有类型的交互,该方法还提供了信息相关抗体的抗原决定基。

这些信息是至关重要的发展的抗原疫苗生产或开发接触后治疗。

这些信息已经采购,审核并改编自怀亚特提供的材料技术。欧洲杯足球竞彩

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