扩散相互作用参数（KD）作为胶体和热稳定性的指示

对于治疗性生物分子来说，稳定性是一个关键的质量属性，对于建立类药物性质和在人类中使用的适用性非常重要。然而，建立候选分子或制剂的稳定性既费时又费力。

生物制剂的开发人员正在寻找能够测试和排序候选物，缓冲条件和赋形剂的不同组合的高通量筛选技术，以减少时间，努力和与长期稳定性研究相关的成本。

在这些筛选中使用的实验方法需要识别各种稳定性指示参数(sip)，因为目前还没有单一参数显示出长期保质期或暴露在一系列环境压力(如冻融或高温)下的稳定性。

短期聚集，热稳定性和胶体稳定性是迄今为止最有用的啜饮。短期聚集代表小聚集体的形成，热稳定性是蛋白质的倾向聚集和/或展开温度，通常是因为疏水芯的暴露。

胶体稳定性是与疏水性表面残留物，表面电荷和类似部分相关的弱，有吸引力的力的分子倾向。这些啜饮并不完全独立于彼此。

例如，胶体稳定性通常与可逆缔合有关，但在自吸引条件下增强的邻近性能够促进不可逆聚集率。然而，增加的表面电荷可以增强胶体的稳定性，降低胶体的吸引力，但降低热稳定性，因为蛋白质的三级结构不稳定的电荷。

静态光散射、红外或拉曼光谱、圆二色、本征和本征荧光、差示扫描量热法等方法已被用于评价SIPS。然而,动态光散射（DLS）是一种多功能的技术，因为它能够对与稳定性有关的广泛现象提供定量的洞察。

它可以通过在经由温度转换的纯粹展开和聚合之间分化通过区分聚集大小和热稳定性的聚集和分布。胶体稳定性可以通过扩散的浓度依赖来测量。可以通过分析相同的数据来确定特定体积和平均摩尔质量的变化。

生物分子的稳定性不是完全的内在性质，因为它受蛋白质被配制和缓冲组合物的浓度的影响。必须以特定的离子型，离子强度，pH和赋形剂曲线的函数测量蛋白质稳定性，用于最佳和成功的制剂。

幸运的是，DLS可以在平板阅读器的帮助下，使用工业标准的微孔板进行每小时数百种条件下的高通量、低量筛选。怀亚特科技的DynaPro平板读卡器可以使用动态光散射（HTS-DLS）执行高吞吐量筛选。

它含有96,384或1536孔板，并同时进行所有样品的温度扫描，温度范围为4-85℃。可以将HTS-DLS提供的多路复用方法扩展到各种其他配方条件以快速表征蛋白质行为。

图1所示。Dynapro Blate Reader能够实现聚集和稳定性指示参数的高通量DLS研究，在制剂研究中的降低生产率。

同时测量热和胶体稳定性提供了定性的独特数据:胶体和热稳定性机制之间的直接相互作用，由热转变附近的胶体相互作用参数的温度依赖性表示。

本文讨论了HTS-DLS测量，这揭示了热诱导蛋白在胶体相互作用上展开的影响，并提供了迅速等级蛋白质制剂的定量度量。

相互作用参数

由于布朗运动的原因，DLS可以直接测量散射强度的起伏，研究了平动扩散系数D_t以及分子大小的有效度量——流体力学半径R_h．

DLS也可以获得粗略的尺寸分布，以评估单体和聚集体的群体。虽然与分离方法不如分离方法，但诸如偶数排除色谱耦合到光散射检测器（秒筒），但DLS通常足以用于筛选目的，甚至甚至会揭示大小在半径中占3-5倍的大小群体的存在．

D_t是浓度的函数(c)，因为主要由带电和疏水残基产生的非特异性蛋白质-蛋白质相互作用。分析D_tVs. c得到一阶扩散相互作用参数k_D如下式所示。

d = D.₀(1 + k_Dc +…)

k的正值_D表示分子间的排斥作用，负值表示吸引力。扩散相互作用参数与第二维里系数a有直接关系₂，常见的热力学测量胶体稳定性和聚集趋势。

测量一个₂较低，高吞吐量通常非常困难和k_D充当一个方便的代理。因此，可以使用k_D为了快速比较不同蛋白质配方和更稳定的生物分子的选择或工程。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

Dynapro Blate Reader对并发热，胶体和混合稳定性分析进行了HTS-DLS测量，也评估了聚集的程度和尺寸分布。在井中完全原位测量样品的能力是该仪器的关键优势。

该功能消除了微流控平台常见的遗留问题，同时提高了吞吐量。通过溶解单克隆抗体(MAb)制备原液₁)在pH值为6.5、7.5、8.5和9.5至最终浓度为15 mg/mL的50 mM双三丙烷缓冲液(BTP)中。

下一步骤是将储备溶液过滤至0.1μm，并在384孔微量滴定板（Aurora）中以六种不同的蛋白质浓度为0.47-15mg / ml的每种pH值中的每一个重复稀释和排列。．每个孔都装满20μl溶液。

然后将板在400g下离心1分钟，然后使用1-2滴石蜡覆盖每个孔以防止蒸发。在进行测量之前，将板在400g下在400g下将第二次离心。

最初的测量是在25°C下使用牛血清白蛋白和溶菌酶的对照样品在同一个平板中进行的。然后进行一个扩展的温度测量序列，以0.1°C/min的速率从25°C逐步增加到85°C。

马伯的₁在斜坡过程中，每0.5°C，在三口重复井中，在每种浓度和pH下，完成5次2秒的采集。动力学软件e来自Wyatt技术和Microsoft Excel用于执行仪器控制，数据采集和分析。

采用自相关分析确定D_t和R_h和k_D是由D_tvs. c, R的曲线_h与温度适合适当的模型以确定聚集生病温度T_发病．

结果与讨论

相互作用参数与pH的关系

马伯的₁抗体显示逐渐降低_t（或增加r_h作为浓度（图2））的函数，匹配负k_D以及相应的蛋白质对蛋白质的吸引力。这马伯₁显示K._D< 0的所有pH值测试(图3)，表明倾向于组装成低聚物物种。

图2。测量的水动力半径作为浓度和pH的三个蛋白质的函数。

图3。相互作用参数k_D，作为三种蛋白质pH值的函数。

Thermally-Induced聚合

超越55°C约55°C的热过渡₁抗体在pH8.5的pH8.5时迅速聚集成大络合物，_h在80到800 nm之间的75°C（图4）之间。T._发病随着浓度的增加而降低，温度范围从55.0°C到56.8°C(图4，插图)。

图4。水动力半径作为温度和浓度的抗体制剂在pH8.5的函数。高阶骨料形成对于温度> 56°C是明显的。

最终的聚集状态很大程度上取决于浓度，在最高和最低浓度之间，粒子的平均大小相差两个数量级以上。欧洲杯猜球平台在70 - 75℃，第二次转变发生，可能与IgG的另一个结构域的展开有关。

这就导致了粒子的大规模聚集，其大小大于1µm。欧洲杯猜球平台T.his high level of aggregation indicates that the observed concentration reliance beyond the thermal transition is mainly due to higher molecular collision rates.

这可以通过改变温度升温速率来验证。但是，在pH9.5，mAb₁抗体显示来自r的变化_h= ~4.8 nm，这是IgG的一个特征，在超过62°C的温度下，根据浓度，稳定值在15到22 nm之间(图5)。

图5。流体动力半径作为在pH 9.5下的所有抗体浓度的温度的函数表现出乙状结族关系，在浓度中显示出中点的几乎没有变化。

通过该pH的聚集体的稳定性和微小尺寸表示可逆的低聚，并且可以通过改变斜坡速率或反转温度斜坡或两者的组合来验证该稳定性和微小尺寸。在大约75℃下，抗体出现进入次级展开过渡，类似于pH8.5，尽管具有相对较小的聚集量，但在较低浓度下没有重大影响。

在两种条件下的聚集过程中观察到的定性变化，在DLS正则化分析获得的尺寸分布中得到了补充解释。80°C的温度和浓度为1.88 mg / mL, pH值8.5示例显示了一个双峰分布的数量30到100 nm和300 - 3000 nm),而pH值9.5样品在相同的浓度水平显示只有一个分布在80到300纳米(图6)。

图6。通过正则化在80°C获得的尺寸分布。左：ph 8.5;右：ph 9.5。

通过热转换的交互参数

k_D在热转变以下为负值，并且对于这两组pH值，随温度的升高大致保持不变。pH为8.5时，k_D是pH9.5的两倍，表明分子间吸引力较强，这与极其不同的聚合行为相对应。

k_D对pH值表现出明显的转变行为，接近折叠-展开转变，接近聚合开始。

k_D在pH 8.5处经历从53°C至59°C的重大阶跃变化（图7和插图）。有趣的是，在发生任何大量聚集之前，变化在发生几度开始，表明由于纯粹的展开而增加的蛋白质 - 蛋白质吸引力。

图7。在pH 8.5下，最低浓度下的扩散相互作用参数(符号，左轴)和半径(实线，右反轴)作为温度的函数。插入：相同，突出过渡区域。

k_D在超过59°C时是恒定的，尽管当存在双峰种群时，由于分配平均半径的数值复杂性，它是有噪声的。聚集的程度取决于浓度，如图4所示。

然而，这似乎表明了更高的碰撞率。因此，k的量化值_D而大于~56°C则只能反映聚合过程的动力学和历史，而不能反映实际的热力学相互作用。

在pH9.5时，K的类似变化_D表示展开的转换：在聚合之前，K_D变得更吸引人(或消极)，但不是一个步骤变化，局部最小值发生时，定量流体力学半径开始显示聚集(图8)。

k的范围_D在这一聚合后减少了减少负面。这是k的这种变化_D建议在初始展开过渡期间增加的相互作用增加，因为疏水芯暴露。

图8。在最低浓度下扩散相互作用参数（符号，左轴）和半径（实线，右倒轴）作为pH9.5的温度的函数。插入：相同，突出过渡区域。

相反，一旦在这样的条件下得到稳定的结构，相互作用就会部分减少，因为暴露的区域对解是隐藏的。在75℃左右，k明显出现二次展开转变_D．

结论

通过在早期开发阶段进行蛋白质制剂，研究人员可以专注于最可行的候选者，并节省大量的时间和精力，样品和测试设备。本研究表明，Dynapro读数器如何使用如何在筛选过程中同时确定蛋白质的胶体和热稳定性和真正的聚集状态，以对制剂条件和候选分子的有效性进行排名。

胶体稳定性和热稳定性被测量为k_D和T_发病， 分别。k的温度依赖_D提供了对展开过程对胶体相互作用的影响的更好的理解，因为这个过程显示了早先从蛋白质和缓冲液中隐藏的部分。

DLS可以提出化学稳定性;溶液中的特异性体积和平均摩尔质量作为温度的函数;和溶液粘度，这是高浓度的生物治疗剂的发展中的另一个主要方面。

HTS-DLS提供了大量数据，用于快速筛选缓冲条件，候选分子和赋形剂，以更高的生产率。

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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