测量生物系统的光谱特性有多种原因。染色/天然细胞和组织吸收和释放光线，留下清晰的光谱特征。光谱学是一种多功能工具，通过这种独特的指纹光谱帮助检测和测量物质，可以被认为是一种“化学视觉”。
肿瘤形成的发生和性质可以通过测量，例如，细胞学和组织学样本，甚至使用光纤探针测量活体组织光谱轮廓的轻微变化来确定。视网膜疾病的状态也可以通过光谱检测来检查。
成像技术
在荧光显微镜下，一些荧光探针被用来标记活的或固定的细胞。每个探针都是特定的细胞内成分。挑战在于从这一系列荧光标记中分离出不同的但频谱重叠的信号，以创建一个精确、定量和高对比度的浓度、位置和正在分析的细胞内成分的相互作用的代表。
这是一个合理的挑战，因为在后基因组时代，涉及多重标记的当代方法正在重新定义如何研究和解释关键蛋白质的功能、细胞生理机制和相关疾病状态。虽然拉曼光谱是一种本质上很弱的现象，但与标准荧光波段相比，拉曼光谱具有非常窄的带宽。
拉曼光谱适用于空间重叠的多物种的光谱识别，与多变量和反褶积分析相结合时效果更强。
光谱成像的感知最初在卫星成像和机载监视领域得到支持，它创建了跨越第三光谱维度的定量二维空间图像，以创建“数据立方体”，从而创建描述试验区域化学成分的光谱数据。
在这种类型的配置中，入射信号的一条线可以聚焦在成像光谱仪上，由此产生的光谱分散光投射在成像CCD的一个区域上。当CCD以足够快的帧率运行时，机载飞行器和连接的检测系统将扫描整个地面，并快速建立3D数据。接下来，数据立方体可以通过两种方式来可视化:
- 可以产生一组不同的单波长图像
- 从图像上的任何空间点都可以得到光谱
当光谱分散在许多光谱通道时，这种方法被称为多光谱或超光谱成像。光谱成像技术在诸如监视等领域的发展已经持续了20多年，所产生的大部分数据都可以用来解决生物学上的挑战。
多光谱成像
在荧光显微镜领域，尤其是活细胞领域，多光谱成像有助于从全面标记的样本中获取完整的动态数据。定量光谱“分解”算法可用于将每个图像点的光谱解卷积为其组成发射物种及其相对贡献。
解混可以有效地应用于几种染料的光谱重叠的情况。这允许在荧光共振能量转移(FRET)和共定位方法中使用荧光蛋白，如GFP及其最常见突变、YFP、CFP和ds-RED(图1)。
图1所示。重叠荧光蛋白发射光谱的示意图。典型的宽自体荧光也显示。
FRET特别容易产生相当大的光谱“串扰”。为了实现有效的FRET，受体染料的吸收光谱和施主染料的发射光谱之间应该存在相当程度的重叠。
这种情况往往不可避免地伴随着两个发射光谱的显著重叠，就像标准的FRET对GFP/YFP的情况一样。
荧光共振能量转移
成功的FRET可以通过混合使用窄带滤波器并将光谱离散图像分割到两个相机或同一相机内相邻的视场上来实现。通过激发受体和供体物种，然后从两个“基于滤波器的通道”中分离，可以降低串扰的影响。
通过这种技术，可以实现两个或三个荧光团的快速并发成像。在需要处理大量荧光团的情况下，特别是当荧光团在光谱上有更多重叠时，串扰成为一个主要问题。
在这种情况下，需要更多的频谱通道来有效隔离信号。然而，与使用窄带滤波器将信号与紧密重叠的荧光团分离不同，可以执行快速多光谱成像，并可以收集整个未过滤的发射光谱，然后进行分解。
如果实现了这样的配置，那么就可以实现更好的信噪比图像，因为不需要通过窄带滤波器丢弃大部分释放的光子。样品中的任何自荧光都可以通过光谱成像和分离来分离和去除。
尽管这种方法在多光谱图像分离方面提供了实质性的好处，但也存在许多技术挑战。理想的光谱成像系统将具有几个关键特性。
这种类型的系统将能够以快速的方式收集光谱数据来创建数据立方体，允许动态样本的吞吐量和分析。光谱成像系统将在最大探测器量子效率(QE)、最小探测器噪声和高光学吞吐量方面具有足够的灵敏度，以产生高信噪比(S/N)。已经证明，在这种情况下，光谱分离的效率要高得多。
需要足够的光谱分辨率才能有效隔离成分样品-所需的光谱通道数量由
- 贡献重叠物种的数量
- 现有的参考发射光谱是否可用来解混合或是否记录了“未知数”
如上所述，如果必须收集波长范围内的整个重叠光谱，并防止使用窄带滤波器作为探测通道，则不需要丢弃光子来获得首选的光谱分辨率和分离。该方法具有较高的分辨率、较高的信噪比和更准确的定量。
EMCCD技术
来自Andor的EMCCD技术可以集成到超灵敏的光谱成像装置中。独特的信噪比远远大于传统CCD相机提供的快速读取速度。
由于EMCCD是一种快速读出的成像设备，它产生的帧速率适合于记录更快的数据立方体或动态FRET事件。
在所有活细胞的直接成像研究中，最好通过减少对光毒性细胞/组织的损伤和集成荧光团的光漂白，尽可能长时间地保存活体。因此，EMCCD检测技术大大有利于这些技术。
EMCCD具有所需的速度和灵敏度，可以捕捉到来自弱发射物种的高光谱分辨率和信噪比图像集，并允许激光激发功率的衰减。通过使激发功率最小化，可显著降低细胞光毒性和染料光漂白率。
在使用ccd进行光谱分解的传统方法中，使用色散元件，如光栅，将波长分离的光投射到阵列的单个维度上。专用的光谱CCD格式专门用于这类应用程序——这种格式可能有一个扩展的形状，标准像素格式为1600 x 200或1024 x 128。
在标准的光谱学读出模式下，光线沿较长的水平维度分布，提供> 1000“光谱通道”，而垂直柱被放入芯片中，产生更大的光收集区域，加快可获得的光谱帧率。
安道尔先进iXon3 EMCCD相机功能成像传感器格式如1000 × 1000或512 × 51。这些像素格式被设计用于典型的光谱模式，沿着垂直列维度执行广泛的垂直分类。
Andor的NewtonEM EMCCD相机是一种新型的专用光谱EMCCD相机。该USB 2.0， -90°C热电(TE)冷却平台提供1600 x 128或1600 x 256像素格式，并已适应快速低光光谱应用。
光谱成像光谱仪
还有其他有用的方法通过光谱读取emccd，例如，可以使用成像光谱仪，如安多尔的三叶树303i，它将提供沿入口狭缝尺寸的空间分辨率。它可以以绝对图像的形式读出EMCCD，其光谱分辨率沿垂直空间和垂直于此的水平轴尺寸。
图2显示了线照明的光谱色散。此外，传感器可以沿阵列的几个水平磁道读出，具有软件可配置的位置和大小，每个磁道产生单独的光谱，例如，对应于来自样本中某一点的光纤输入。
图2。由直线照明产生的光谱色散
如果需要达到异常快的光谱速率，可以有两种选择，但每种选择的光应该只分散在传感器上有限的行数，而没有任何光落在其余的活动区域。以“快速动力学模式”读取成像EMCCD有助于获得最快的时间分辨率(图3)。
图3。快速动力学读出
在这种配置中，频谱分布在传感器顶部的几行。下面的“暗行”被用来存储从暴露区域向下移动的光谱。直到整个传感器充满为止。
整个区域被正常读出，多个光谱被软件处理。可以将时间分辨率降低到通过一个步骤将这些行向下移动所花费的时间，即和或iXonEM+EMCCD范围可以调整为< 1个µs/row，最多1999个存储行。
如果实验需要快速的光谱时间分辨率，但不能受传感器存储大小的限制，则可以在“裁剪传感器”模式下读取EMCCD（图4）。在这种模式下，传感器可能会被欺骗，认为它比实际更小，并且可以以相对较快的帧速率持续读出。
光谱时间分辨率由读出传感器较小定义部分所花费的时间控制。例如，通过将分散光定向到iXonEM+ DU885-K底部的10 x 1000区域，以35兆赫像素读数，就可以以每秒数万个光谱读数。利用电磁ccd的超灵敏和快速读取特性，已经应用了几种新的光谱成像方法。
图4。裁剪传感器模式
多光谱共焦扫描
下一代多光谱共焦扫描是一个正在解决的领域。虽然有几种商用系统可用于多光谱共焦点扫描显微镜，但已知有些系统存在主要缺点。
有几个格式特别值得一提。在一种配置中，光栅必须用来分散从指示扫描点通过32个光电倍增管(PMTs)的线性阵列的共焦信号。这主要是由于pmt的量化宽松程度低，特别是对红色，以及相邻通道的不同反应。在另一种商业格式中，单个PMT用于检测，在激光停留在图像点上的时间内，光栅在光谱范围内倾斜扫描。
很容易相信，对> 512 x 512的250000像素图像进行光谱扫描需要大量的时间。此外，这种构型不适合动态系统的光谱分析，也容易受到样品广泛光照的不利影响。
为了解决这些问题，emccd系统可以实现多光谱共聚焦扫描。通过利用>90%的单光子灵敏度量子效率、背光传感器、快速像素读取速度和阵列结构，这种方法得到了改进。
激光的停留时间应设置为对应时间暴露和读出的短行32像素,这足以使成功分离的几个已知发光染料,从而导致了数据立方体的512 x 512 x 32只需要不到1秒。
即使使用更少的频谱通道，也可以预期更快的速度。与pmt技术相比，EMCCD像素具有明显的灵敏度优势，红色像素高达10倍，蓝绿色像素约为5倍。显微镜中的多光谱成像也可以通过使用包括透射色散光栅的模块来实现，例如检查器。
在这些系统中，探测和色散的光学原理与前面提到的机载监测稍有相似。该系统被放置在EMCCD和显微镜之间，光线从样品上x方向的一条被照亮的线中收集，线照明来自激光或过滤灯。
从线路收集的光分布在EMCCD阵列区域，甚至是现有区域的一部分，以获得更快的帧速率和更低的分辨率或光谱范围（图5）。EMCCD柱上的像素提供λ分辨率，通过电动工作台递增移动样本来扫描y方向。
对于每一级步骤，应暴露并读出被照亮阵列的区域。emccd的超敏感性能非常适合这种方法，允许更快的读数性能和更短的曝光时间。
图5。线扫描光谱成像
结论
EMCCD的性能可用于加速光谱成像方法，其中使用液晶可调谐发射滤波器在光谱范围内连续获得λ-图像堆栈，涉及整个区域的照明和成像，每次波长。
这种方法经常受到采集速度的限制，但由于EMCCD技术提供的读取速度和灵敏度优势，这种方法得到了显著提高。一个可调谐波长激发源也可以被扫描来执行激发光谱成像，检查随后的发射强度。然后，谱分离算法可以很容易地应用于以这种方式获得的数据。
这些信息都是从Andor Technology Ltd提供的材料中获取、审查和改编的。欧洲杯足球竞彩
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