高速非线性光学Pump-Probe显微术是什么?

非线性光学pump-probe显微镜是一个新的领域,在现代显微镜三维高分辨率成像。成像对比依赖于特定分子的光谱特征属性,即他们的特定的内部能级结构。

非线性件轻松事交互用于选择性探测器光谱指纹,产生一种形象,揭示了目标分子的空间分布。根据该方法,刺激能源转换可以在可见范围内,分子电子转换或分子键的振动共振红外范围。

一个典型的图像和512×512像素100µm占地面积100。图像是连续记录在不同的焦平面与一个典型的垂直间距1µm获得高分辨率的3 d图像。

相比其他非线性光学成像方法如荧光和非相干拉曼显微镜,刺激和读出的非线性相互作用是通过至少两个脉冲的定义的属性:泵和探测脉冲。不连贯的过程,如自发发射的抑制刺激读出的关键优势之一。

高激发激光功率敏感检测结果结合在一个高效的非线性相互作用的整体收益率,使快速图像采集时间。样品照片损坏,是由高功率的激光引起的减少是由于短激光曝光时间。荧光成像技术相比,不需要特定的分子标记为样品制备。

减少图像采集时间,这通常是直接关系到检测灵敏度,是当前研究的主要目标之一。现代扫描显微镜技术使收购次高达30帧为512×512像素的图像^[1]这样的收购*促进快速三维成像。然而,它可以记录2 d图像video-rates动力学分析在复杂的生物系统在微观范围内。

非线性光学pump-probe显微镜有能力执行3 d成像在组织内部,使之成为一个潜在的非侵入性成像技术在生物医学提供补充数据目前应用荧光和磁共振成像技术。

表1。波长是例子^[2]c - d和碳氢键的振动

振动	碳氢键	c - d债券
Ω	2875厘米1	2100厘米1
λP	830海里	830海里
λ年代	1090海里	1005海里
λ一个	670海里	707海里

相干拉曼显微镜

振动指纹molecule-selective成像是利用相干拉曼显微镜。相干anti-Stokes喇曼散射(汽车)和受激拉曼散射(SRS)将在本文中讨论。

图1描述了一个说明相应的多光子过程SRS和汽车。这两种技术涉及相干激发分子振动的同时应用近红外斯托克斯和可见泵脉冲共振频率差异Ω。斯托克斯和泵需要同步脉冲在时间和必须遵守的相位关系引发这些多光子过程。

图1所示。非线性光学pump-probe显微镜是一个新的领域,在现代显微镜三维高分辨率成像。

SRS探针振动激发态通过确定分子之间的能量交换和激光场引起的非线性相互作用。这种能量交换体现在斯托克斯脉冲的强度增加(受激喇曼增益)和探测脉冲的强度损失(受激喇曼损失)。

非线性相互作用不断开启和关闭斯托克斯的强度调制脉冲的测量。泵上的损失受激拉曼脉冲调制,可以确定锁定放大器。这种检测方法,也称为调制传递,使快速成像。一个例子是video-rate体内SRS成像证明了萨尔河等^[3]。

另一个可能的实现调制传递SRS显微镜是调节泵脉冲和斯托克斯脉冲检测受激喇曼增益。

汽车探测激动的振动共振通过监控刺激anti-Stokes排放。然而,直接检测的敏感性anti-Stokes排放受到疲软的背景对anti-Stokes排放的贡献,与任何振动共振。白天复习等^[4]提到了两个不同的锁定计划背景免费汽车成像和高灵敏度。

第一个锁定技术是调频汽车(FM-CARS),首次实现了Ganikanov et al^[5]。泵的调频脉冲调节振动共振频率Ω。然后,anti-Stokes信号解调技术代表的频率导数anti-Stokes发射激励频率。因此,背景的贡献被拒绝,因为它平坦的频率响应。

第二锁定技术是干涉型汽车,由Potma实现等^[6]第一次。之间存在干涉相位调制在anti-Stokes本地振荡器的脉冲频率和成像的anti-Stokes发射标本。

如有交期共振anti-Stokes贡献和背景之间的关系,正确的本地振荡器光学相位调整导致background-free振动吸收信号。阶段的振动响应是完全解决化学选择性之间重叠的不同分子的共振债券,根据Jurna最近的实验等^[7]。

非线性吸收显微镜

的成像对比非线性吸收显微镜是基于特征分子电子转换。在调制传输技术,非线性相互作用是检测到的激光场和分子之间的能量交换。最近的最小et al^[8]提供了大量的非线性吸收成像的例子。图2显示了两个吸收过程。

图2显示了两个光子的吸收,通过一个虚拟的状态,只要他们的频率匹配一个激发态的总和。这个过程称为双光子吸收(TPA)。

必须同步激发脉冲在时间和服从的相位关系。还可以发现TPA当两个光子的波长是相同的,只要两个光子相互作用强度调制。你们解释等^[9]响应的非线性吸收过程,调制频率的两倍。

图2 b显示一个潜在的过程发生在瞬态吸收(TA)成像。激光频率调谐电子跃迁和泵之间的介绍了飞秒时间延迟和探针脉冲。

然后,瞬态吸收探测脉冲的吸收是由于前面的泵脉冲。基态电子泵脉冲激动的配置如图2 b所示。

电子在激发态时,探测脉冲可以看到极化子的人口比,没有泵脉冲小。结果,探测脉冲的吸收更少的泵脉冲相比,在泵脉冲的缺失。

也可以询问激发态的衰减动力学通过改变脉冲之间的延迟,而应用于pump-probe光谱探测器飞秒电子动力学。

图2。为非线性吸收过程的例子。

实验例子

受激拉曼散射显微技术

德龙张和米哈伊尔Slipchenko季新集团的程普渡大学建立了一个SRS成像设置,所述^[2]。图3显示了部分相关调制传递SRS实验及其互连。

光学参量振荡器(详细的)由飞秒钛泵:蓝宝石激光振荡器提供了两个可调激发脉冲(泵和斯托克斯)。随后,一个声光调制器(急性中耳炎)用于强度调节斯托克斯脉冲在5.4 MHz。由此产生的斯托克斯脉冲时空上然后用泵脉冲重叠。的锁定放大器提供了5.4 MHz参考载波。

图3。SRS显微镜使用的Zhang et al^[2]与落后的荧光成像技术有关的部分省略。在左边列表中提到的所有涉及光学频率。波长代:泵与飞秒脉冲产生泵激光(重复频率80 MHz)。可调泵(680 - 080 nm)和斯托克斯(1000 - 1600 nm)提供一个光学参量科裕tor(详细)。同步调制:时间同步的脉冲火车延迟阶段和强度调制在5.4 MHz acousto光学调制器(急性中耳炎)。调制载波的HF2LI喂给司机。激光扫描显微镜:显微镜和激光操舵控制的显微镜控制器。

高数值孔径的目的是用来激发光束聚焦到样品和另一个显微镜物镜是用于收集SRS和汽车产生的信号样本,前进的方向。

从输出脉冲光过滤泵脉冲后,他们测量了光电二极管和解调HF2LI测量受激喇曼损失。解调信号传输到显微镜控制器通过HF2LI的辅助输出。

一个创新功能的显微镜^[2]飞秒激光脉冲的应用程序而不是广泛使用的皮秒脉冲。飞秒激光脉冲能够激动人心的隔离振动共振更好,由于增加短脉冲的激发带宽。

Photodamage生物样本是一个重要的问题,因为更高的飞秒激光脉冲的峰值功率。作者解决这个问题通过平衡激励力量近红外脉冲斯托克斯(40兆瓦),在可能的情况下photodamage相比相对较小,可见泵脉冲(10 mW)。同时,图像被收集在高速高灵敏度。像素的停留时间,这是一个样品的激光的曝光时间像素,仍低于4µs。

合成的脂质滴(LD)组成的细胞内脂肪酸(FA)储能,正如前面研究Slipchenko et al^[10]使用拉曼显微镜领域研究的焦点之一。摩门教的合成从内源性细胞内的葡萄糖存在取决于在拉曼成像碳氢键转移2875厘米¹。

氘添加外源性FA与特征响应的喇曼转变从c - d债券2100厘米¹使SRS成像在LD区分内生和外生FA。这个原则是如图4所示。

图4。适应与许可^[2]。版权2011年美国化学学会。图中显示SRS和传输图像的CHO细胞孵化7小时的细胞培养基补充100µm氘软脂酸(外生FA与c - d振动)。图4 c显示了c - d振动和表示的SRS图像存在外生FA LD和细胞膜。图4 g显示了SRS的碳氢键振动图像相同的细胞,显示细胞内源性FA的分布。值得注意的是,LD 4 c、4 g的位置表明,即使细胞补充外源性FA,胞内LD同时包含内生和外生足总。这表明,细胞仍然综合内生FA促进LD的形成。传输图像如图4 k缺乏任何SRS图像中发现的化学信息。比例尺:5µm。

在这项研究中,3 d SRS麻醉的秀丽隐杆线虫线虫也收集图片的碳氢键振动。从这些图片,LD的3 d地图分布在创建蠕虫。总的来说,50帧是在不同的海拔有512×512像素的像素停留时间2µs。

考虑梁的重新定位在每个框架中,它只需要55秒获得150 x 150 x 50µm形象。此外,SRS显微镜可以用于其他成像方法如双光子荧光,可以检测到向后方向不使用锁定放大器。

瞬态吸收显微镜

欲望和勇Wan Potma组加州大学欧文分校构造一个非线性显微镜能够执行瞬态吸收(TA)成像与信号采集的HF2LI^[11]。表2列出了相关的飞秒脉冲的重复频率80 MHz。

表2。瞬态吸收过程的组件

激励脉冲	输出脉冲
ω1:泵脉冲(mod)	ω1:泵脉冲(mod)
ω2:探测脉冲	ω2:探测脉冲
	ω2:瞬态吸收(mod)

探测脉冲和泵脉冲的波长943 nm和820 nm,分别。泵脉冲通过急性中耳炎和探针脉冲通过调整脉冲间隔的延迟延迟阶段,如图3所示。泵的激发力量1兆瓦脉冲探测脉冲和0.5兆瓦。调制频率为1.5 mhz。

一旦与样品发生交互,探测器上的瞬态吸收脉冲与输出脉冲由HF2LI光学滤波和解调。然后信号传输到显微镜HF2LI的辅助控制器的输出。

波长配置利用TA的欲望惠特莫尔使用受激发射在金属结构成像的对比。因此,个人单壁碳纳米管(碳)与金属属性可以被可视化。

尽管碳纳米管有可能在许多领域提供创新的解决方案的技术,他们很难合成与特定的材料属性。他们必须单独选择特征并与特定的材料特性的制造过程。

非线性光学pump-probe显微镜能够快速电子动力学的研究助教可以用于这一目的。光学响应弱是由于纳米管的非常小的尺寸,需要长时间图像采集。的最大像素住photodamage时间有限,应用基于帧的平均而不是单个扫描采集时间长。图5说明了碳纳米成像像素20µs停留时间。

图5。适应与许可^[11]。版权2011年惠特莫尔的渴望。图5是一个扫描电子显微镜(SEM)图像的合成碳纳米钛垫电气特性。SEM解决碳纳米管个人,任何信息关于电子性质。图5 b显示了TA同一地区的形象。作为碳纳米管的反应取决于激光脉冲的光学偏振,只有横向对齐碳纳米是可见的。通过改变脉冲间隔的延迟,单个碳纳米管金属的电子动力学进行了研究。助教的垫解决图像由于其金属属性。像素停留时间是20µs像素停留时间越长,100年µs导致photodamage碳。图5 c显示了同一地区的传播形象并从碳不显示任何签名。

用户利益

相比其他商用设备,苏黎世仪器HF2LI锁定放大器的特性,为高速非线性光学pump-probe显微镜是必不可少的:

• 最快780 ns的滤波器时间常数
• 120分贝动态储备最佳信噪比
• 频率范围50 MHz
• 辅助输出采样在1 MS / s
• 6解调器花在一个锁定装置
• 采用市场上最先进的集成组件

调制频率总是低于40 MHz的典型的脉冲激光重复频率80 MHz。HF2LI的频率范围是一个完美的适合这些条件。可以设置解调带宽高达200千赫的快速扫描速度,通过选择一阶滤波器时间常数780 ns。

快速输出和解调信号的采集,可以避免不必要的扭曲通过更新的辅助输出HF2LI每一微秒时间等距样本。在这些输出200千赫滤波器抑制混叠。

HF2LI辅助输出的最大有效解调带宽147 kHz,考虑到两个滤波器传递函数的叠加。另外,使用USB电缆,200千赫带宽可以达到与数字样本传输到计算机。

一个可实现的成像帧速率HF2LI用于信号采集不同的决议在表3中做了总结。每帧的像素数量是最左边的列所示。率是5%,例如帧速率,解调滤波导致增加5%尺寸最小的可分解的特性。

它假定所有的帧率最小的可分解的特性是由两个像素采样。例如,128 x 128µm是512 x 512像素的帧的大小。零时间假定后续帧的帧率如表3所示的收购。详细的计算中可以找到^[12]。

表3。实现与HF2LI成像帧速率

帧的像素	5%	10%	20%
512 x 512	1.2帧/秒	1.7帧/秒	2.3帧/秒
256 x 256	4.9帧/秒	6.7帧/秒	9.4帧/秒
175 x 175	10帧/秒	14帧	20帧

可以实现高速显微镜与10个或更多的帧每秒的最小代价特别决议。除了相干喇曼和非线性吸收显微镜,非线性pump-probe光热光谱分析显微镜成像技术研究也可以受益于快速检测性能。

HF2LI也有两个信号输入和六个解调器花,可用于各种检测方法。一个例子是同时测量调制传递,这是决定在第一频道,单光束双光子吸收,发现第二通道的HF2LI任意调制频率的谐波。

因此,有必要扩展光设置检测同时收集pump-probe脉冲。Pseudoheterodyne检测方法^[13]是另一个例子,振动相位干涉测量汽车设置的光学相位调节器。

确认

苏黎世仪器由于米哈伊尔Slipchenko从普渡大学和欲望惠特莫尔加州大学欧文分校(目前是加州大学伯克利分校)的支持和分享他们的测量结果设置,这个应用程序的示例中所示的实验。

引用和进一步阅读

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12. 派生苏黎世仪器所示博客,www.zhinst.com
13. 苏黎世pseudoheterodyne检测仪器应用注释在光学、www.zhinst.com

这些信息已经采购,审核并改编自苏黎世仪器提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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