选择正确的色谱检测器

在最近的一篇文章中，Viet Pham讨论了关于“我应该买哪个色谱检测器?”．虽然Viet很好地概述了不同类型色谱的不同选择，但他只简要地提到了使用凝胶渗透色谱(GPC)或尺寸排除色谱(SEC)的最重要类型:多角度光散射(MALS)。

SEC/GPC的问题

大多数类型的分析色谱依赖于通过参比分子的柱校准。标准品可以运行，保留时间可以根据分子性质进行校准，分子可以注射，这些分子的性质可以通过插入保留时间图来估计。

对于大多数类型的色谱来说，这是一个合理的方法，而且不容易产生太多的系统误差来源。这种经过尝试和测试的方法在大量的分析中是通用的。然而，SEC/GPC色谱柱校准受制于主要的系统误差来源，因为分离原理与被测量的参数只有松散的联系。

尺寸排阻色谱的原理就是——它根据尺寸进行分离，特别是通过流体力学体积，由于在固定相中扩散到孔内外，小分子比大分子洗脱得晚。

大多数实践者实际上喜欢测量分子量，而不是流体力学体积。对于任何给定的大分子，水动力体积和分子量之间的关系取决于密度和构象。与支链聚合物等致密分子相比，线性聚合物表现出不同的关系。

球状蛋白与部分无序蛋白、多肽或具有扩展三级结构的多结构域复合物有着不同的关系。因此，如果样品和参考分子在密度或构象方面没有相似之处，那么使用典型的标准品如球状蛋白或线性聚合物进行柱校准将导致测量不正确。

你是特别的吗?

一些类型的样品，如聚乙二醇化、共聚物或糖基化蛋白质缺乏适当的校准标准，或者可能没有适合你的流动相的参考分子。此外，非理想的柱间相互作用会影响保留时间和偏斜SEC柱校准。

非空间相互作用如静电和疏水是这种非理想行为的一些常见例子。对于大的支链聚合物，支链锚定在GPC填充孔中会导致更大的分子稍后洗脱，与预测的洗脱顺序相反。

虽然LC质谱法可以提供准确的分子量，但它有很多局限性，包括不能代表实际的溶液行为。非共价结合的低聚物通常以单体形式出现在质谱中。

解决方案

那么，色谱仪需要采取哪些措施来实现可靠、准确、基于溶液的摩尔质量测量呢?怀亚特科技说解决方案是光(TM)。MALS可以定义为溶液中大分子的大小和摩尔质量的第一性原理测量。

它不依赖于柱校准(这不应该与蒸发光散射混淆，蒸发光散射可以测量浓度，并且总是用于柱校准)。SEC和MALS的结合形成了SEC-MALS系统，其中色谱柱的唯一功能是进行分离，允许MALS在任何给定的洗脱时间测量单个大小的分子。

只要实现了良好的分离，SEC-MALS并不关心样品如何与色谱柱相互作用。这导致了准确和可靠的结果，即使色谱是在流动相之间或不能重复运行-不需要重新校准。

完整的SEC-MALS系统具有在线MALS检测器、行业标准的高效液相色谱仪器组和在线浓度，通常基于微分折射率(dRI)或紫外吸收。如果您使用Waters的APC用于聚合物或UHPLC-SEC用于蛋白质，则可以使用兼容的dRI探测器和小体积MALS。

所有的大众，无论大小

一切群众，不论大小。

SEC-MALS能够覆盖很大范围的摩尔质量,从200克/摩尔到数亿,实际上远远大于可能被秒。不同的分离方法分离必须用于更大的纳米粒子和高分子,以及任何其他分子不工作列。欧洲杯猜球平台

非对称流场-流动分馏(AF4)被认为是与MALS集成的最通用的基于尺寸的分离技术。它能在1纳米到1000纳米之间分离纳欧洲杯猜球平台米粒子和大分子，对大多数物种来说，它的分辨率即使不是比SEC更好，也和SEC一样好。AF4也是许多分析物的选择方法。

除了摩尔质量

除了提供摩尔质量的绝对第一性原理测量，SEC-MALS还定义了分子大小和构象，并分析共轭分子，如共聚物、糖蛋白和蛋白质-碳水化合物复合物。

大小和形态

对于rms半径(Rg)大于10 nm的分子，MALS同时用摩尔质量来测量尺寸。此外，多相聚合物的大小和摩尔质量的组合可以创建一个构象图，可以解释聚合物是支化还是线性的，以及分支的程度。

大小与摩尔质量的比例也将揭示蛋白质是否部分无序、完全折叠或变性，这可以与电子显微镜和SAXS数据进行比较，以评估扩展复合物的形状。

如果分子小于10纳米，它们的大小可以用微分粘度计或动态光散射(DLS)测量。由于这种技术也使用了流池和激光束，MALS可以与在线DLS集成，消除了额外的检测器增加色散色谱峰的需求。通常，但不总是，DLS用于更紧密的蛋白质和聚合物的粘度测定。

使共轭共聚物和微观

由于没有合适的参考标准，柱校准不能用于表征共轭蛋白和共聚物。三探测器系统:SEC-UV-MALS-RI是分子表征的主要手段。结合的信号被检查以确定两个组成物种的分子量，如碳水化合物和蛋白质或两种类型的聚合物，以及总分子量。

另一组不适合柱标定的分子是表面活性剂溶解的膜蛋白，也可以用SEC-UV-MALS-RI进行表征。绝对测定溶液中蛋白质的真寡聚态，无论是膜蛋白还是其他类型的蛋白质，是SEC-MALS在生命科学领域的一个重要应用。欧洲杯线上买球

判断错误会导致可怕的后果!

描述有信心

技术人员和科学家需要可靠和可重复的分子属性值，这可能对他们有用。认识到所有测量方法都受到随机、偏差和系统误差的影响，我们可以尽可能地减少这些误差。

生物化学家和分析化学家使用GPC或SEC，他们也采用了MALS来确定绝对大小和摩尔质量，以全新的视角看待他们的分子-对结果和扩展的表征能力有了新的信心。

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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