使用UHP-SEC来表征具有光散射的聚合物GydF4y2Ba

UHP-SEC已成为合成聚合物分析的首选技术。显著减少了样品/溶剂的消耗以及运行时间提供了可观的时间和成本节省效益。考虑到更好的分离分辨率和相应的低聚物和单体的定量增强，以及根据需要返回标准GPC的灵活性，转向高效UHP-SEC系统的情况是明确的。GydF4y2Ba

分析UHP-SEC的缺陷GydF4y2Ba

尽管UHP-SEC有明显的优点，但仍有一些缺点需要解决。第一个缺点是柱标曲线的隐含假设:不同的洗脱时间本质上意味着不同的摩尔质量，摩尔质量越小，洗脱时间越长。考虑到这一逻辑，一个狭窄的标准将在一个非常狭窄的峰洗脱，实际上比固有的展宽，因为有限的柱体积。事实上，即使是一个狭窄的标准洗脱液，其宽度——假设，通过柱校准——对应的摩尔质量最小跨度为2 - 4倍。GydF4y2Ba

表面化学是第二个缺点:当改进分离方法时，应找到待测试样品和参考标记理想地相互作用(例如通过电荷或疏水相互作用)与柱填料的条件。这是因为柱校准依赖于样品和参比分子只与柱发生理想的(空间位阻)相互作用的假设，任何额外的“粘性”将导致不准确的结果。GydF4y2Ba

相对于HPLC-SEC色谱柱，相对较少的表面化学可用UHP-SEC方法优化，因此有一个更高的可能性，该方法将不会完全优化。第三个缺点是色谱条件下的柱漂移和蠕变:在如此快速的分离过程中，由于样品上样、柱老化或泵操作条件的改变，即使洗脱时间有微小的变化，也会导致估计分子量相对较大的误差。GydF4y2Ba

解决方法:光散射GydF4y2Ba

在线多角光散射（MALS）GydF4y2Ba^{1，2GydF4y2Ba}可以确定地确定每种洗脱体积的聚合物的摩尔质量，没有参考保留时间。这种技术通过摩尔质量（m），散射强度（i）之间的第一原理进行了物理关系。GydF4y2Ba_{散射GydF4y2Ba}），散射角θ和浓度（c）：GydF4y2Ba

eq。1GydF4y2Ba

P(θ)是一个角函数，它依赖于分子的均方根半径rGydF4y2Ba_GGydF4y2Ba， K为比例常数，可由测量系统的特性，如激光波长等测得。因此，c和I的测量GydF4y2Ba_{散射GydF4y2Ba}直接得到r的值GydF4y2Ba_GGydF4y2Ba和M，当溶液通过MALS检测器的流单元时，连续地。分子量的测定是独立于形状，构象，以及洗脱性质。GydF4y2Ba

由于这些原因，SEC-MALS，利用OptilabGydF4y2Ba^®GydF4y2BaT-REX差分折射仪和黎明GydF4y2Ba^®GydF4y2BaMALS检测器，传统上是严格分析由标准HPLC-SEC分离的溶液中的聚合物和蛋白质的金标准。一个SEC-MALS系统，包括内置GydF4y2BaWyattQELS™动态光散射(DLS)模块，GydF4y2Ba增加了分子尺寸（流体动力半径）的第二个独立测定。使用Viscostar III用于在线测量的内在粘度是确定通常与聚合物一起使用的流体动力半径的另一种方法。通过进一步分析分子尺寸和摩尔质量之间的关系，可以确定聚合物构象，例如随机线圈，细长或支链。GydF4y2Ba

Optilab.GydF4y2Ba^®GydF4y2BaUT-rEX折射率探测器和μDAWNGydF4y2Ba^®GydF4y2BaUHP-SEC MALS探测器GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba赋予嵌入式DLS和MALS在较新的分离技术上的优势。UHP-SEC- mals，也称为“μSEC-MALS™”商标，保留了UHP-SEC的主要优势，同时保持色谱分辨率和提供绝对分子大小和洗脱物种的重量。GydF4y2Ba

图1显示了μsec-MAL的意义，呈现30kDa聚苯乙烯标准的三种注射体积的色谱图。基于洗脱时间的色谱图的缺乏术语将表明50μL注射液主要由4μL注入中的物种较小。它还建议在相应的峰值中覆盖20-40kDa或10-40kDa的宽摩尔质量范围;然而，MALS分析表明，两种喷射都包含狭窄的分布在30kDa约为30kDa。GydF4y2Ba

图1。GydF4y2Ba用UHP-SEC洗脱2次30kda聚苯乙烯(4 μL和50 μL)。相对于色谱柱的摩尔质量范围较宽且差异较大，MALS证明两者在30 kDa左右的分布较窄。GydF4y2Ba

所有已知和未知GydF4y2Ba

根据普遍接受的标准验证一种不熟悉的技术总是有用的，甚至是必要的。这些标准是用于UHP-SEC的线性聚苯乙烯，而SEC-MALS分析的一系列聚苯乙烯标准具有相当丰富的信息。光散射得到的摩尔质量与柱校准曲线完全吻合，如图2a所示。然而，在大多数峰的平面MALS结果清楚地表明，这些聚苯乙烯标准是相对均匀的，这不能建立单独的柱校准。GydF4y2Ba

图2。GydF4y2Ba(a)一系列线性聚苯乙烯标准品的叠加色谱图。MALS分析表明高对应的计算分子量与校准曲线，并提供了真正的同质性在每个峰。(b)一系列PMMA样品的叠加色谱图。MALS分析表明，由于各峰的分支构象和内部不均一性，导致了与柱标的偏差。每个峰的异质性。GydF4y2Ba

另一方面，由于存在分支，PMMA的洗脱与线性聚苯乙烯有很大的不同。如图2b所示，用MALS测量的这些所谓的“未知”样品的摩尔质量并不像聚苯乙烯标准那样完全一致，而且每个峰都相当分散。然而，MALS给出了一个完整的图，精确的摩尔质量和分布范围从数百到数百万g/mol。GydF4y2Ba

Sec-MALS与μsec-malsGydF4y2Ba

重要的是验证反向标准的新方法，也必须与旧技术进行比较。多年来，SEC-MALS一直是评估聚合物摩尔质量和大小的事实标准。目前的μSec-MALS仪器涵盖了UHP-SEC柱的整个范围（MW：300 DA - 10GydF4y2Ba^6.GydF4y2Ba对于线性聚合物，Da更高，rms半径:10 nm - 50 nm)，尽管它不包括标准SEC-MALS的整个尺寸范围(MW: 300 Da - 10GydF4y2Ba^9.GydF4y2BaDa, rms半径:10 nm - 500 nm)。交叉验证一致证明μSEC-MALS和SEC-MALS之间具有良好的一致性。考虑到在高压下在紧密密封的UHP-SEC柱上剪切聚合物的潜力，这个比较特别具有启动性。GydF4y2Ba

如图3所示，分析了1.5MDA聚苯乙烯样品，其特征在于μSec-MALS（红色，早期洗脱色谱图）和SEC-MALS（绿色，晚洗涤色谱图），其流速为0.5ml /分钟。在两种分析中，重量平均摩尔质量精确地出现（1.56±0.01）x 10GydF4y2Ba^6.GydF4y2BaG /mol, z-平均RMS半径分别在63.0和61.5 nm处基本一致。因此，可以得出结论，剪切不会发生，至少在这些条件下。在更高的流速下发生剪切的可能性还有待测试。GydF4y2Ba

图3。GydF4y2Ba1.5 MDa分子量聚合物的SEC-MALS(绿色，迟洗脱)和UHP-SEC-MALS(红色，早洗脱)色谱图，均为0.5 mL/min。MALS分析的重量平均摩尔质量和z平均rms半径表明，与标准GPC色谱柱相比，UHP-SEC色谱柱没有降解。GydF4y2Ba

非线性构象-不是障碍GydF4y2Ba

聚合物可以采用各种构象，例如随机线圈，棒状和支链。每个构象表示流体动力学体积和摩尔质量之间的不同关系，从而不同的洗脱体积和摩尔质量之间的不同关系。GydF4y2Ba

一些环氧树脂，与聚苯乙烯或PMMA不同，是伸长的和刚性的，就像刚性杆一样。这些环氧树脂的细长形状产生了相对大的流体动力学体积，因此它们比这些大分子中的任一个更早地洗脱得多。GydF4y2Ba

如图4a所示，是三种UHP-SEC色谱图对应于这三种类型的聚合物以及由μSec-MALS测量的摩尔质量。虽然该特定的PMMA样品不重要，但其摩尔质量/洗脱体积关系仅偏离聚苯乙烯的略微偏离，因此环氧树脂（EP）明显地从其他两个差异化。在每种洗脱体积，EP的摩尔质量比相应的聚苯乙烯物质低约40-50％。GydF4y2Ba

洗脱行为的差异是不同构象的直接结果。虽然这种差异不会被标准分析秒识别，但它被突出显示并立即通过MALS显示，并且建立了实际的摩尔质量值。GydF4y2Ba

两个EP样品的摩尔质量值和色谱图如图4b所示。摩尔质量沿色谱图几乎完全匹配，表明这些环氧树脂具有相同的构象，尽管它们跨越不同的范围和具有相对不同的分布形状。表1列出了矩和多分散性值，这表明每个样品都有很好的重复性。GydF4y2Ba

共聚物的分析是聚合物表征最困难的任务之一。由于不具备良好的，因此可用于这些相对异质的复合物的窄参考标准，因此不可能通过柱校准分析。GydF4y2Ba

分析共聚物的最常用方法是三重检测组合UV，MALS和DRIGydF4y2Ba^4.GydF4y2Ba．两个独立的浓度信号的组合足以建立衡量dn /直流值和共聚物比随后插入光散射方程(Eq。1),找出每个组件的摩尔质量的复杂以及整体的摩尔质量。用于共聚物分析的三重检测系统的所有主要组件都很容易获得，并以UHP-SEC格式结合良好:UHPLC泵和柱以及在线RI, UV和MALS检测器。因此，SEC-MALS标准方法很容易推广到μSEC-MALS。GydF4y2Ba

图4。GydF4y2Baa) μSEC-MALS研究了刚性棒状环氧树脂(EP)对线性聚苯乙烯(PS)或微支化PMMA的洗脱行为。在每一个洗脱体积下，PS和PMMA的摩尔质量相当相似，而EP的摩尔质量明显较低，这是由于EP具有坚硬的棒状构象。B)两种环氧树脂样品的μ sec - mal分析。其中一个样品表现出明显的低摩尔质量峰，而摩尔质量沿色谱图完全重叠，表明两个样品具有相同的构象。GydF4y2Ba

实验GydF4y2Ba

文书，如AcquityGydF4y2Ba^®GydF4y2BaUPLCGydF4y2Ba^®GydF4y2Ba系统与APC 125和450 Angström孔SEC柱(Waters Corp.， Milford, MA)， anGydF4y2BaOptilab UT-rEX折射率探测器GydF4y2Ba使用μDAWN MALS检测器(Wyatt Technology Corp.， Santa Barbara, CA)获取本研究的数据，并使用Wyatt Technology的ASTRA进行分析GydF4y2Ba^®GydF4y2Ba软件典型条件为进样量4 ~ 20 μL，流速0.5 ~ 1.0 mL/min。更多的试验表明，任何给定物种的洗脱量可能随流速不同而不同;但是，在0.05 μL/min和2ml /min的流速范围内，通过光散射确定的摩尔大小和质量却没有变化。GydF4y2Ba

表1。GydF4y2Ba两种环氧树脂的摩尔质量矩和多分散性值以及实验不确定性(精度)，每一种都有两次重复。随后的几次运行之间的协议很好。GydF4y2Ba

	Mn (kDa)GydF4y2Ba	兆瓦(kDa)GydF4y2Ba	PD (Mw / Mn)GydF4y2Ba
EP1 (001)GydF4y2Ba	1.55±0.02GydF4y2Ba	3.26±0.01GydF4y2Ba	2.10±0.03GydF4y2Ba
EP1 (002)GydF4y2Ba	1.55±0.02GydF4y2Ba	3.25±0.01GydF4y2Ba	2.10±0.03GydF4y2Ba
EP2 (001)GydF4y2Ba	3.58±0.07GydF4y2Ba	7.90±0.02GydF4y2Ba	2.21±0.04GydF4y2Ba
EP2 (002)GydF4y2Ba	3.47±0.06GydF4y2Ba	7.96±0.02GydF4y2Ba	2.30±0.04GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

UHP-SEC为表征大分子提供了许多优势，包括合成聚合物，从数百g/mol到数百万g/mol的大小。然而，这只能通过μDAWN在线光散射检测器实现，以绝对测定摩尔的尺寸和质量，从而解决尺寸排斥色谱在UHPLC环境下可能加剧的固有限制。GydF4y2BaUHP-SEC-MALSGydF4y2Ba能够表征复杂分子，例如共聚物，拉长或支链聚合物，这些没有可用的参考标记。因此，光散射是分析、工艺开发和QC实验室实施UHP-SEC的重要工具。GydF4y2Ba

参考文献GydF4y2Ba

1. P.J. Wyatt，Analytica Chimica Acta 272,1-40（1993）GydF4y2Ba

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3.V.H. Hsieh和P.J. Wyatt，科学报告7，文章编号:10030 (2017)GydF4y2Ba

4.罗兰和施特里格尔，GydF4y2Ba分析化学GydF4y2Ba84GydF4y2Ba(11), 4812 - 4820 (2012)GydF4y2Ba

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