为什么一个拉曼光谱的获取时间至关重要

在共焦拉曼成像中，一个拉曼光谱的采集时间是至关重要的，因为它会影响图像的获取时间，而图像的获取时间通常包含数以万计的拉曼光谱。本文展示了光谱EMCCD如何用作检测器，以将获取时间大大减少到每个光谱的几毫秒，并显着提高整体敏感性。

共聚焦显微镜背后的工作原理

共聚焦显微镜使用了点光源（激光），该聚焦显微镜聚焦在样品上。反射（荧光）光通常以相同的物镜收集，然后聚焦在检测器前面的针孔中。This makes sure that only light from the image focal plane reaches the detector, which robustly increases the image contrast and, with appropriate selection of pinhole size, somewhat increases the resolution.

在共聚焦拉曼成像中，如alpha300 R系统用于此处描述的实验，专用过滤器用于抑制反射的激光光，同时允许使用光谱仪和CCD摄像头组合检测到拉曼散射光。为了实现图像，在很短的时间内获得了数千个光谱，每个光谱的整合时间通常小于100 ms。

由于拉曼散射横截面非常小，激发能力仅限于几毫瓦，因此如何改善共聚焦拉曼系统的整体灵敏度？

优化S/N比率提高了CRM系统的总体敏感性

优化信噪比（S/N）很重要。最初的步骤是增强收集的拉曼信号，这可以通过优化光谱仪和显微镜的吞吐量以及使用高数值孔径（NA）的目标来实现。使用共聚焦设置，来自异常区域的不良背景信号将减少，并进一步改善S/N。

使用具有最高灵敏度的适当检测器

接下来是具有最高灵敏度的合适检测器的选择，例如反向释放的CCD，该检测器的量子效率超过90％。读数噪声和暗噪声是检测器本身噪声的主要来源。目的应该是消除所有其他噪声源，以便光子射击噪声是唯一剩下的噪声。

由于光子遵循泊松统计量，因此对于给定的信号，不确定性是电子中信号的平方根。在没有其他噪声来源的情况下，对于100个电子的信号，S/N不能大于10。

暗噪声降低了CCD的冷却效率

暗噪声归因于CCD中的热产生的载体，通过CCD的有效冷却可以大大降低。良好的CCD在-60°C下的热暗电流小于0.01电子/像素/秒。因此，不需要在-60°C以下冷却几秒钟。与共聚焦拉曼设置一样，在少于100 ms的集成时间内，暗电流完全可以忽略不计。在将收集的电子更改为数字计数时会产生读取噪声，并受到CCD读数放大器的质量和读取过程的速度（数字化速率）的限制。相机制造商指定了电子中给出的读数噪声。典型的值是50 kHz读数速率的5-10个电子，即2.5 MHz读数速率的大约30个电子。

读数噪声限制

据说，如果读数噪声超过光子射击噪声，则该信号将受到读数噪声的限制。在通常的光谱实验中，将简单地增加积分时间以获得足够的信号，以确保射击噪声再次受到限制。但是，在共聚焦拉曼显微镜中，这并不总是可能。

如果通过仅1秒的集成时间/频谱获取由128个像素/线和128条线组成的图像，则总获取时间为4,5小时，在100的整合时间中，其缩短至小于30分钟MS或少于3分钟的集成时间为10 ms。但是，从检测器中读取的速度越快，读取器的噪声越高。

装有50 kHz读数放大器的1024x128像素CCD可以在大约22毫秒内读取，这也恰好是最短的集成时间。假设有10个电子的读数噪声，则将读取100个电子/像素以下的每个信号有限（泊松噪声<读取噪声）。对于快速读数放大器，如果读数噪声为30个电子，那么即使是900个电子（检测器上〜1000个光子/像素）的信号也将受到读数有限。

什么是电子乘以CCD

电子乘以CCD（EMCCD）是标准CCD，具有额外的读取寄存器，其驱动的时钟电压比通常的CCD读取寄存器更高。由于这种高时钟电压，通过撞击电离的电子乘法可通过可调节的总体放大，最多可调节1000次。使用此设置，信号始终可以放大读数噪声上方，因此即使使用快速读数放大器，信号的泊松噪声也总是受到信号的泊松噪声的限制。例如，本文中用于实验的1600 x 200像素EMCCD具有2.5 MHz读数放大器，只需2.3 ms即可读取。

计算显示不同信号的S/N的改进

下面给出的计算证明了S/N中的增强功能，可以预期不同信号。假定CCD具有90％的量子效率（QE），并且信号放大设置为一个值，在该值中，单个A/D计数等于读取噪声的电子数（1 A/D计数= 30电子2.5 MHz读数放大器）。

如果100个光子在指定的集成时间内落在CCD像素上，则将生成90个电子并转换为3个A/D计数。泊松噪声为9.5，约为0.3 a/d计数，读数噪声为1 A/D计数。对于这些数字，S/N比约为2.6。

在EMCCD中，电子增益因子将乘以高达1,000的信号。通常，将使用一个较小的扩增因子，但对计算没有改变，90个电子将被扩增至90,000个电子，导致3,000个A/D计数。泊松噪声为9,500个电子，可转换为317个计数，而1个计数读数噪声完全可以忽略不计。S/N为9.5，这是3.6倍的改善。

如果信号仅为10个光子，则标准CCD的信号仅为0.3，但是在这种情况下可以忽略泊松噪声。在1个计数读数噪声的情况下，S/N仅为0.3，这几乎是可检测的信号。对于EMCCD，信号为333个计数，泊松噪声为100个计数，可提供3.3的S/N - 在正常CCD上改善了11倍。

实际上，电子乘法过程本身增加了一个额外的（所谓的多余噪声系数）约为1.4，因此对于上述示例，S/N的实际改进分别减少到2.6和7.9。

在较高信号的情况下，如果信号强度不再读数限制，则EM过程的过量噪声因子将EMCCD的S/N比降低到小于正常CCD的噪声系数。在这里，可以关闭EM寄存器，并且可以使用“正常”读取寄存器。因此，EMCCD与通常的后刷CCD一样工作。

聚合物样品的共聚焦拉曼图像

图1中所示是非常薄的PMMA膜的三个共聚焦拉曼图像，并旋涂在玻璃基板上。在图像的中间，用金属针头进行垂直划痕，以取下PMMA层。膜的厚度是用AFM在此划痕上确定的，为7.1 nm。同样，可以看出，厚度为4.2 nm的额外污染层。首先，该污染层的材料组成和起源尚不清楚，但可以由共聚焦拉曼测量。

图1。（a） - （c）在3000 / cm大约3000 / cm的CH2拉伸带中获得的7.1 nm薄PMMA层的共焦拉曼图像。比例尺：10 µm。（d）样品的示意图30 x 50 µm，100 x 80像素= 8000光谱，110 ms/spectrum。

为了获得图像，在50 x 50 mm的扫描范围内获得了200 x 200的拉曼光谱，并且PMMA的CH2拉伸带的强度约为3000 / cm。激发功率为20 mW @532 nm，使用100倍，Na = 0.9物镜。使用62 kHz的读数放大器和36 ms的集成时间/频谱使用读数放大器，并使用正常的反向释放（BI）CCD获取图1A。有了一点想象力，图像中间的划痕很明显，但是S/N比率远小于1。

图1b中显示的是用EMCCD成像的样品的同一部分，增益约为250。图像显示几乎相同的S/N，但现在积分时间仅为3.6 ms，比图像快10倍1a。对于图像1A，完整的图像采集花了25分钟，但对于图像1B，仅需3.4分钟。图1c是用EMCCD获取的，但现在的集成时间与图1A相同。划痕可以清晰地看到，跨玻璃表面和PMMA的针状结构的污染也可以看到，这将在后面进行讨论。样品的草图如图1D所示。

对于下一组图像，使用了具有Na = 1.4的油浸入物镜，并将样品倒置。集成时间为7 ms/频谱，导致收购时间为5.4分钟（包括回扫描的0.3s/线）。在相同条件下获得的十二张图像从16 x到1,000 x不同，如图2所示。从图像可以看出，S/N比强烈增加到增益设置约为200 x。在此之上，图像中没有看到S/N的进步。

图2。与EMCCD增益不同的不同设置获得的共聚焦拉曼图像的比较。

在图3中，PMMA的CH2拉伸带的信号的S/N比与EMCCD增益绘制。信号的标准偏差被视为噪声。可以看出，信号增加到300 x的增益设置，这似乎是最佳设置，但高于此值，S/N值再次略微降低。使用适当的增益因子，总改进超过5倍。

图3。来自EMCCD增益的PMMA CH2拉伸带的信号的S/N比。

污染物的识别

由于共聚焦深度分辨率有限，因此所获得的光谱都不是纯PMMA光谱或污染层的纯光谱。但是，通过在划痕区域获得的所有光谱而没有任何污染，获得了纯玻璃光谱。

纯PMMA和污染光谱可以通过分别从PMMA光谱和污染光谱中减去玻璃光谱来计算。考虑了这些光谱进行基础分析，其中每个测量的光谱均拟合为基本光谱的线性组合。

使用此方法，可以实现三个分布（PMMA，玻璃和污染）分布的图像，这些图像是颜色编码的（红色= PMMA，蓝色=玻璃和绿色=污染）以查看它们的分布（图4））。

图4。7.1 nm PMMA层（红色）和4.2 nm污染层（绿色）的颜色编码的共焦拉曼图像（蓝色）。200 x 200光谱，7 ms集成时间/光谱。总收购时间5.4分钟。

不同组件的光谱如图5所示。为了更好地比较，它们的最大强度相同。相对于玻璃光谱，将PMMA光谱放大了约20次，并将污染光谱放大了约15次。

图5。拉曼光谱是根据图4中的拉曼测量得出的，其最大强度相同。该比例仅适用于PMMA。PMMA光谱被放大了约20次，相对于玻璃光谱，污染光谱约为15倍。

由此，绿色光谱（污染）可以很容易地将其识别为烷烃。为了研究AFM厚度，在拉曼测量前几周制备样品，并保存在聚苯乙烯（PS）容器中。PS容器是通过注入成型产生的，并用烷烃涂有霉菌，以更好地分离。由于样品是存储的（也许是在温暖的环境中），因此烷烃的一部分在样品上蒸发和凝结，这解释了针状结构以及划痕被涂层覆盖的事实。

图5中给出的比例对PMMA是正确的，最多只有28个计数。在完整的CH2伸展机制（约150像素或330 / cm）上平均的信号为1965年。该测量的EM增益约为600 x，因此1965年的计数对应于每个CCD像素最大1.4个光子，总计99个电子（110个光子）！但是，如何获得如此少的电子的良好拉曼频谱？原因是将大约20,000个光谱平均以测量图5所示的PMMA光谱。因此，总信号高20,000倍。

相反，只有在存在PMMA的地方获得了这些光谱。为此，每个频谱的信号必须足够强，以显示拉曼图像中的PMMA分布，因为这将使选择合适的平均光谱变得容易。可以观察到，在这种情况下，每个EMCCD像素的1.4光子足以查看PMMA层的分布，并为平均过程选择正确的光谱。

如果使用了CH2拉伸方案中没有任何背景信号的底物，则结果将更加令人印象深刻。PMMA，玻璃和烷烃具有相同强度尺度的三个光谱如图6所示。

图6。与图5中的光谱相同，但标度正确。

可以看出，所使用的玻璃基材具有一个小的拉曼峰，约有三分之一的烷烃信号和该区域的PMMA信号的一半。显然，拉曼系统的共同点对于薄层的可检测性很重要。即使使用最合适的共聚焦设置，信息深度也不少于500 nm，这意味着500 nm的玻璃有助于拉曼信号。由于拉曼信号与材料量成正比，因此典型的（非相关）设置将收集高于300倍以上（170 µm盖玻璃厚度）以上的玻璃信号，从而使甚至无法检测到薄涂层层有相对较长的集成时间。

概括

结果表明使用EMCCD相机可以显着提高速度和检测效率，尤其是对于共聚焦拉曼显微镜所需的短整体时间。对于每个光谱，可以轻松地检测和鉴定出7.1 nm PMMA和4.2 nm烷烃层在玻璃基板上的分布，并将整体采集时间降低到200 x 200（= = =），将整体采集时间降低到5.4分钟（=40,000）光谱共焦拉曼图像。

如果由CCD的读数噪声主导的非常小的信号，与最佳可用标准CCD相比，使用EMCCD摄像机可以提高S/N比5-10。对于较大的信号，可以简单地关闭电子乘电路，并保持正常（后刷）CCD的所有属性。

此信息已从WITEC GMBH提供的材料中采购，审查和调整。欧洲杯足球竞彩

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