使用在线多角光散射和差分粘度率表征透明质酸gydF4y2Ba

由gydF4y2Ba怀亚特技术gydF4y2Ba2018年1月9日gydF4y2Ba

透明质酸（HA）被认为是天然存在的非支链多糖，其包括交替重复的D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺单元。这种生物聚合物存在于所有哺乳动物系统中，但主要发生在滑膜（关节）液体，玻璃体幽默和不同的松散结缔组织（如雄鸡梳子）（如雄牛肉）（1）中。HA对医疗，药理学，眼科和化妆品应用具有巨大的商业兴趣。gydF4y2Ba

透明质酸是一种在生物学和商业应用中的天然聚合物。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba透明质酸是一种在生物学和商业应用中的天然聚合物。gydF4y2Ba

透明质酸已被广泛研究（1-7）。HA的物理化学行为密切相关，如分子量分布（也称为多分散指数[PDI]），内在粘度（[η]），重均分子量（mgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba)和分子构象。gydF4y2Ba

以前的HA研究包括许多尺寸排除色谱（SEC）实验。标准秒涉及色谱分离样品，用浓度检测器监测输出，例如UV吸光度检测器或折射仪，并将洗脱时间与摩尔质量相关。在该形式中的SEC被认为是纯相对测量，因为色谱系统必须最初用一系列已知的摩尔质量标准校准，以便产生校准曲线。校准的准确性依赖于含有与参考标准相同的构象和柱相互作用的分析物。gydF4y2Ba

其他秒的HA研究已经集成了gydF4y2Ba多聚光散射（MALS）设备gydF4y2Ba符合浓度探测器的串联。这被证明是有益的，因为SEC-MALS是一种非常敏感的技术，用于测量绝对摩尔质量，这些技术不依赖于校准标准的校准标准或关于分子构象的优先假设。用SEC-MALS，可以确定样本的根均线半径rgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba，提供样品RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba大于约10nm。gydF4y2Ba

在意大利米兰的Istituto di Chimica delle macromolecules, Mendichi团队在添加在线单毛细管粘度计(2,3)的情况下，对HA的secs - mals进行了几个优雅的实验。这种探测器的组合不仅产生了上述所有的材料特性，而且还澄清了样品的特性粘度和分子构象，利用Mark-Houwink-Sakurada (MHS)关系。gydF4y2Ba

然而，单毛细管粘度率基本上容易受到系统压力波动产生的噪声。即使使用脉冲泵和傅里叶变换数据滤波（8,9），也已经显示了单毛细管粘度探测器S / N的仅大约125：1。这种技术的另一个缺点是使用大量公认标准依赖校准。gydF4y2Ba

与单毛细管粘度率相比，差分粘度率主要是有益的，如图所示。本文介绍了SEC-MALS-IV，用于使用差分折射测定法，MALS和差分粘度测定探测器与SEC分离使用差动折射动术，MAL和差分粘度探测器的绝对测定。gydF4y2Ba

欧洲杯足球竞彩材料和方法gydF4y2Ba

样本gydF4y2Ba

七个不同的HA样品用于本研究。HA消息源包括脐带，雄鸡梳状和细菌发酵。从Sigma（St.Louis，Missouri）获得了卵蛋白。所有其他化学品都是分析级。gydF4y2Ba

分析仪器gydF4y2Ba

通过HPLC系统和自动注射器（Agilent 1100 [Agilent Technologies，Wilmington，Delaware]，900μL注射回路）组成的色谱系统以及溶剂脱气剂（ERC L761）。SEC柱系统由聚合物实验室（Amherst，Massachusetts）Aquagel - OH（8μm）分离柱，带防护柱。流动相是磷酸盐缓冲盐水（PBS，8mM二元磷酸钠，22mM磷酸钠磷酸钠，双去离子水中的150mM氯化钠）。流速为0.5毫升/分钟。色谱探测器包括黎明gydF4y2Ba^®gydF4y2BaMALS装置，粘星gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba差分粘度计和OptilabgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba差动折射仪系列（来自Wyatt Technology，Santa Barbara，加利福尼亚州）。gydF4y2Ba

在PBS中均为0.1mg / mL HA。注射体积为900μL。这gydF4y2BaDN / DC.gydF4y2BaHA的值0.167ml / g，从文献（1）中获得。选择低浓度和大的注射体积，以防止分离塔内的HA样品的电位粘性指法。为每个样品进行多次进行注射，以验证结果的可重复性。gydF4y2Ba

MALS检测器确定绝对摩尔质量，无需列校准，参考标准或“软糖因素”。差动折射仪用于浓度测量。通过珀耳帖装置的热控制允许在室温或低于室温下的热稳定性，从而稳定的基线和非常高的S / N。gydF4y2Ba

差分粘度率gydF4y2Ba

差动粘度计使用标准的四臂毛细管桥设计（图2）。该桥梁由四个相等阻抗毛细管组成，其左下臂具有有效零阻抗延迟体积。随着移动相通过装置传播，桥梁中心的差压（ΔP）换能器读取零。当样品进入桥时，它均匀分裂。当样品进入延迟容积时，三个毛细管包含样品，一个含有一个只包含流动阶段。这在ΔP检测到的桥内产生压力不平衡。样品特异性粘度（ηgydF4y2Ba_spgydF4y2Ba)可以直接从ΔP压力不平衡和设备进口压力(IP)的组合中确定，通过Stokes-Einstein方程(10)得到的后续关系:gydF4y2Ba

［2］gydF4y2Ba

其中η是样品粘度和ηgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba是溶剂粘度。gydF4y2Ba

差动粘度计设计。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba差示粘度计设计原理图。gydF4y2Ba

这是仅在校准压力传感器时依赖的直接测量。桥梁设计基本上对压力波动不敏感，因此能够容忍中等泵脉冲。此外，该装置利用珀耳帖热电装置，用于在巨大的温度范围内进行精密热控制，包括在室温或低于室温。精确的热控制，桥梁设计和现代电子产品的集成在具有优秀S / N的设备中实现了一种设备。Viscostar III中描述了一种更具增强的设计：GPC的在线粘度率的创新。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

用实验收集和数据分析gydF4y2BaAstra软件包gydF4y2Ba（Wyatt技术）。采用该软件允许收集并随后与ΔP，IP和差分折射测定信号一起分析所有18个MAL角度。gydF4y2Ba

两种η知识gydF4y2Ba_spgydF4y2Ba由差示粘度计和由差示折射计确定的浓度c可以使用公式3直接计算特征粘度[η]，该公式适用于洗脱峰上的每个数据切片。gydF4y2Ba

［3］gydF4y2Ba

MALS检测器在每个数据切片上也提供摩尔质量数据，所以整个分布可以拟合MHS方程，gydF4y2Ba

［gydF4y2Baη.gydF4y2Ba] =公里gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}

［４］gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba米gydF4y2Ba是分子量和gydF4y2BaKgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一个gydF4y2BaMHS系数是否与溶剂相互作用和聚合物形状相对应。特别是gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba值是聚合物在溶液中形状的指示，具有较低的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba值（例如，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba< 0.5)表示构象更紧密，更高gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba值（例如，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba> 0.8）表示扩展构象。gydF4y2Ba

还可以确定流体动力学体积V.gydF4y2Ba_hgydF4y2Ba通过爱因斯坦 - 辛哈关系，来自MALS和粘度率测量的样品：gydF4y2Ba

［5］gydF4y2Ba

其中ngydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}阿伏伽德罗常数。水动力半径rgydF4y2Ba_hgydF4y2Ba是计算gydF4y2Ba

rgydF4y2Ba_ℎgydF4y2Ba=（3V.gydF4y2Ba_hgydF4y2Ba/4π）gydF4y2Ba^⅓gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

［6］gydF4y2Ba

通过这种方式定义，rgydF4y2Ba_hgydF4y2Ba是与样品具有相同[η]的球体半径。gydF4y2Ba

带扩大校正gydF4y2Ba

当样品通过探测器行进时，每个流动细胞的表现类似于小混合体积。这些不同的混合室使得最初尖锐的峰与轻微的指数尾部宽。留下未矫正，这导致实验结果略微扭曲（10）。当使用多于一个检测器进行HPLC检测时，存在带扩展。该软件采用专有的带扩展校正算法，能够解决探测器频带扩大的长期问题。gydF4y2Ba

结果和讨论gydF4y2Ba

表我总结了为七个HA样品建立的材料特性。结果与已发布的值（1-3,5）一致。gydF4y2Ba

表I.gydF4y2BaHA样品材料特性总结。gydF4y2Ba

HA样本gydF4y2Ba	哈来源gydF4y2Ba	米gydF4y2Ba_wgydF4y2Ba （g / mol）gydF4y2Ba	PDI.gydF4y2Ba	RgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba （纳米）gydF4y2Ba	[η]gydF4y2Ba (mL / g)gydF4y2Ba	rgydF4y2Ba_hgydF4y2Ba （纳米）gydF4y2Ba
农业的gydF4y2Ba	细菌发酵gydF4y2Ba	2.64 e + 05gydF4y2Ba	1.19gydF4y2Ba	57.7gydF4y2Ba	632.gydF4y2Ba	27.7gydF4y2Ba
HA-2gydF4y2Ba	脐带gydF4y2Ba	2.84E + 05gydF4y2Ba	1.23gydF4y2Ba	66.1gydF4y2Ba	652.gydF4y2Ba	28.3gydF4y2Ba
HA-3gydF4y2Ba	鸡梳gydF4y2Ba	6.62E + 05.gydF4y2Ba	1.10gydF4y2Ba	109.1.gydF4y2Ba	1431.gydF4y2Ba	51.1.gydF4y2Ba
HA-4gydF4y2Ba	细菌发酵gydF4y2Ba	1.10E + 06.gydF4y2Ba	1.45gydF4y2Ba	165.4gydF4y2Ba	1754年gydF4y2Ba	57.7gydF4y2Ba
HA-5gydF4y2Ba	脐带gydF4y2Ba	1.44E + 06gydF4y2Ba	1.06gydF4y2Ba	180.4gydF4y2Ba	2208gydF4y2Ba	77.7gydF4y2Ba
HA-6gydF4y2Ba	鸡梳gydF4y2Ba	1.62 e + 06gydF4y2Ba	1.06gydF4y2Ba	182.4gydF4y2Ba	2671gydF4y2Ba	86.1.gydF4y2Ba
HA-7gydF4y2Ba	“自然来源”gydF4y2Ba	1.76E + 06gydF4y2Ba	1.02gydF4y2Ba	207.9gydF4y2Ba	2655gydF4y2Ba	89.9gydF4y2Ba

图3显示了一个典型的ηgydF4y2Ba_spgydF4y2BaHA样品的色谱图和相关的MgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba，R.gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba和r.gydF4y2Ba_hgydF4y2Ba峰值的值。η的典型差分粘度计s / ngydF4y2Ba_spgydF4y2Ba对于这些HA实验的追踪约为2200：1，比无脉冲，数据过滤的单毛细粘度率更大的数量级。gydF4y2Ba

？样品HA-2的SP色谱图gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Baη.gydF4y2Ba_spgydF4y2Ba样品HA-2的色谱图，相关的mgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba，R.gydF4y2Ba_ggydF4y2Ba和r.gydF4y2Ba_hgydF4y2Ba峰值的值。gydF4y2Ba

为了评估分子构象信息，为所有样品开发MHS地块。图4显示了样品HA-2的代表性MHS图。MHS跟踪的最小二乘回归也可以在图4中可以看出。从这个回归中，gydF4y2BaKgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba样品HA-2的值计算为gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 0.0277gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba=0.817，两个值都接近发布值。然而，这些数字不应该考虑在面值，因为它可以看到，MHS轨迹显示明显的曲率。虽然没有显示，但在本研究中测试的所有七个HA样本显示MHS曲率与图3中观察到的相似。所有的HA MHS图都显示了曲率，因此gydF4y2BaKgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba由MHS图的直接线性回归确定的系数不能被认为是在HA分子量的整个跨度的MHS行为的准确描述符。实际上，这是较早发布的gydF4y2BaKgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba值。gydF4y2Ba

通过使用MHS曲线的多项式拟合（在这种情况下）并因此采用该函数的导数，可以建立瞬时值（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba）：gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba= D（日志[gydF4y2Baη.gydF4y2Ba] / d (logM)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

[7]gydF4y2Ba

Mark-Houwink-Sakurada情节gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Ba样本HA-2的Mark-Houwink-Sakurada图及线性拟合。gydF4y2Ba

图5显示了gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba样品HA-2在低分子量时为1.0，在高分子量时接近0.55。另外6个HA样本gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba行为类似于前面描述的，典型的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba值在低分子量为1.1的值，高分子量为0.5。gydF4y2Ba

Mark-Houwink-Sakurada情节gydF4y2Ba

图5。gydF4y2BaMark-Houwink-Sakurada图，二阶拟合，ai对log(MgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba)样品。gydF4y2Ba

这种差异gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在其摩尔质量范围内表示HA在较低分子量（2）处呈现自由排水，非高斯链条行为。该聚电解质的内置刚度迫使分子在较低分子量下采用更长时间的构象，因此相应高gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba价值。HA缓慢过渡到标准高斯链行为gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba值随着分子量的增加而下降。这有助于解释文献中出现的HA MHS常量的广泛多样性(和不一致性)。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

通过结合差示折射计gydF4y2Bamal乐器,gydF4y2Ba和鉴别粘度计有秒，探索了生物聚合物HA的材料特征。发现分子量分布，绝对HA分子量和半径信息与历史文献值一致。已经发现通过MHS分析阐明的HA分子构象显示出不寻常的行为，如孟基团的早期所示。这些探测器的利用与软件的使用保证准确，快速，绝对地分析此行为，无与伦比的S / N以及任何检测器都需要校准曲线。gydF4y2Ba

参考gydF4y2Ba

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