等温滴定量热法（ITC）是通过检测ITC池中发生的任何反应热来热力学检查分子间相互作用的最可靠和方便的技术之一(1 - 9)．ITC提供了关于结合亲和、结合化学计量和机理、驱动力、(去)水合作用、(去)质子化、相互作用表面积、与盐的相互作用和分子灵活性(如蛋白质动力学)的有益信息(1 - 8、10 - 15)．ITC跟踪Michaelis-Menten动力学的能力[16]、水解[17]，并估计分子相互作用的汇率（即结合和解离率）［18］还将ITC的应用范围扩大到一系列生物系统。
在过去的10年里，两种ITC仪器，VP-ITC (MicroCal™，Malvern Panalytical，英国)和ITC200 (MicroCal™，Malvern Panalytical, UK)对分子缔合的热力学研究做出了显著贡献。PEAQ-ITC (MicroCal™，Malvern Panalytical, UK)最近作为ITC仪器的新型号出现，具有更高的灵敏度，更方便的洗涤模块和方便的分析软件[19]．因此，预计MicroCal PEAQ-ITC也将有助于理解结合能量学，并扩展ITC的应用。
为了获得精确的ITC热图和数据，需要对ITC实验的程序有一个准确的理解。有几本关于PEAQ-ITC的综合手册非常有用和可用［20］获取如何有效地执行实验和检查数据的信息。下面的文章将根据作者在ITC实验中的经验，提供一些实用的关键技巧，以提高PEAQ-ITC的性能及其分析。
气泡形成
更小的细胞体积PEAQ-ITC仪器(大约0.2 mL)比VP-ITC仪器(大约1.42 mL)非常有益;它减少了样品量和所需的实验时间，并能够测量使用VP-ITC无法明显观察到的热变化，如高浓度盐稀释相关的热(图1)。
与低亲和力的分子间相互作用需要ITC滴定至高摩尔比，其中应该使用大量样品。快速平衡和测量最大化ITC测量的数量，用于计算标准偏差和分析特定时间段内各种样品和条件的前景。这些益处在ITC研究中也非常有效地使用聚合 - 易于样本，因为它们会减少可用于聚合的时间。另外，PEAQ-ITC仪器的较小细胞体积是可以降低聚集潜在成核的实用性。但是，在执行比VP-ITC较小的批量较小的PEAQ-ITC时，可能会遇到许多问题，如下所述。
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图1。不同型号ITC仪器监测高浓度NaCl的滴定热。使用VP-ITC(左)和PEAQ-ITC仪器(右)记录ITC滴定注射器将1M NaCl在10 M HCl溶液中滴定到ITC细胞中10 M HCl溶液中的A蛋白的ITC热图。最终滴定后的ITC峰以红色显示，并在插图中放大以供比较。VP-ITC和PEAQITC每次滴定后NaCl的摩尔浓度相同。第一次滴定为2µL，其他滴定为20µL;第一次滴定为0.8µL，其他滴定为2.2µL
剩余气泡的去除(ITC cell)
与使用VP-ITC仪器进行的实验相比，在PEAQITC仪器较小的细胞体积下进行的ITC实验中获得的数据将受到细胞中气泡的存在和发展的更多影响，气泡可以产生基线峰值和低基线。因此，定期清除细胞内的气泡。然而，用户可能会觉得，使用加载注射器将少量溶液加载到PEAQ-ITC电池中以排除气泡并不容易，主要是那些熟悉VP-ITC的人，VP-ITC的电池体积大约是PEAQ-ITC的7倍。
强吹扫（即快速加载）会使样品溶液飞溅，导致样品损失。但是，弱吹扫（即低负荷）将无法成功排出气泡。因此，必须尽可能轻轻地将溶液泵入试管，而不会使样品溶液飞溅。拔出时旋转加载注射器也有利于避免气泡。额外的灯或灯有助于检测气泡，因为电池单元中没有灯。
当加载和清除颜色样品时，尤其是在相对高浓度下的颜色，可以妨碍气泡的观察，以及当使用诸如表面活性剂的泡沫形成样品时，可以妨碍特殊的样品。使用含有表面活性剂溶液中的彩色膜蛋白的实验是经典的实例。使用桌面离心机和/或脱气的短时间离心是有效的，对于抵抗泡沫的产生是有效的。
重复滴定注射器的插入和移除可能是保证ITC盒中样品溶液无气泡状态的最后一步。如果在平衡或早期延迟期间观察到有噪声的ITC热图，停止测量，再次重复插入和取出滴定注射器。
去除剩余气泡（ITC（滴定）注射器）
滴定注射器的容量PEAQ-ITC仪器（约40μL）也小于VP-ITC仪器（约280μL）。因此，保留在PEAQ-ITC仪器的滴定注射器中的气泡可能会影响比VP-ITC的滴定的精确和精确体积。如果检测到泡沫，请按下放置在微量PEAQ-ITC控制软件窗口底部的仪器控制杆中的“柱塞/ refile”按钮，然后尝试删除它们。短的离心和/或脱气是有效的，可以避免气泡的发展。
当气泡持续存在时，通过调节仪器控制条中的ITC滴定注射器的几个主要功能来执行以下步骤:
I.按下'柱塞向下'按钮，清空滴定注射器
2按“加载”按钮
注1：建议使用“负载”功能，因为它伴随着脱气，这对于消除气泡是有效的
注2:在执行“加载”功能之前，“打开填充端口”→“柱塞向下”通常是有效的
3如果气泡没有被清除，重复步骤I和II。
如果以上方法都不奏效，用台式离心机和/或脱气后的样品重新填充。检查柱塞尖端，并考虑在使用超过200 - 300 ITC测量后更换它。
如果计划在滴定注射器中使用相同的样品进行后续的ITC测量，可以在不清洗或漂洗注射器(即简单地清洗细胞)的情况下，将相同的样品装入滴定注射器。用工作溶液冲洗滴定注射器的针尖并擦拭后，按“柱塞向下”按钮，然后按“加载”按钮。这是一种不添加气泡而加载试样的有效方法;但是，对于易于聚集的样本需要谨慎。
ITC电池中的残留溶液
使用者通常用不含分析物的缓冲溶液冲洗ITC电池。这是一个基本和关键的程序，以匹配溶液组件之间的溶液在细胞和注射器，从而减少本底热(即控制热)。然而，在实践中很难用装药注射器消除所有残留在槽内的溶液。PEAQ-ITC仪器的电池中剩余溶液对分析物浓度变化的影响将比VP-ITC仪器更大，因为前者的电池体积比后者更小。
使用不适当的样品浓度进行分析会影响亲和常数(缔合和离解常数)、n值和其他热力学参数的评估，包括熵的变化(Δ年代)、焓(ΔH)和吉布斯自由能(ΔG)，准确度高，重现性好。为了减少这个问题，建议用工作样品溶液冲洗细胞，然后用不含分析物的缓冲溶液冲洗。
剩余的样品溶液在细胞储液器中
为了加载样品溶液并进行后续泵送以消除气泡，将加载注射器插入细胞内是一个必不可少的步骤，将加载注射器的针头排出相应体积的样品溶液。如果样品溶液在取出上样注射器前仍存在于细胞储液器中，则细胞将充满样品溶液。
清洗细胞贮液器和移液管固定螺母的重要性
PEAQ-ITC仪器的系统清洗系统主要由单元单元、清洗模块和控制器PC组成，具有高效、鲁棒性强的特点。然而，粘性样品可能停留在细胞贮液器和移液管固定螺母的底部。因此，建议清洗电池储槽和固定螺母的底部，以确保ITC热图的清洁和分析的成功(图2)。
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图2。PEAQ-ITC移液管装置中的固定螺母图示。固定螺母标有箭头和标签。
清洗和漂洗错误排除
PEAQ-ITC系统灵敏度高、直观。因此，它能察觉系统中的任何不足之处，并为错误创建许多区分大小写的消息。关于清洁步骤出现错误消息时,明智地验证限制的瓶,每个连接的液体,大量的解决方案在每个瓶子(鲜美14%或20% Contrad™70年,加倍的去离子水,(DDW)中所描述的和甲醇(高效液相色谱级或纯> 99%),和液体废物)清洗模块,以及单元单元、洗涤模块和控制器PC之间的连接。
各种各样的技巧
- 使用工作溶液冲洗滴定注射器尖端后，点击仪器控制栏中的“柱塞向下”按钮，从滴定注射器中回收残余样品。
- 使用工作溶液冲洗滴定注射器的尖端，尽可能快速轻轻地擦拭尖端，在将ITC滴定注射器插入ITC细胞之前，注意不要损坏滴定注射器的针。或者，滴定剂将在ITC实验之前与分析物反应。当滴定剂浓度极高时，该程序变得更加重要。
- 在使用DDW重新填充参考池之前，请确保池池是干净的，否则在填充过程中DDW会从参考池溢出，参考池中的DDW可能会被污染。保持细胞单元的清洁是ITC的前提。
工具书类
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20.http://www.malvern.com/
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