改进串行块面扫描电子显微镜的图像质量

Denk和Horstman设计了一种自动化的SBFSEM技术，用于在扫描电镜中获取序列图像进行三维重建¹并被Gatan公司商业化为3View^®系统。由此产生的大容量数据集可以在高轴向和横向分辨率下进行定量评估，就像Leapman等人在Langerhans小鼠胰岛中检测线粒体网络一样。²此外，sbsem在材料科学应用中具有巨大的潜力，可以通过大体积生成纳米分辨率的块状材料和欧洲杯足球竞彩界面的三维图像欧洲杯线上买球^3.．

数据集可能包含数百或数千张图像，因此，污染和充电造成的图像质量损失可能会破坏实验。由于碳氢化合物污染，对比度恶化，必须经常清洗和更换BSE背散射电子探测器。

许多电子显微镜使用远程等离子体清洗蒸发管^®等离子清洁器通过减少或去除污染，从他们的仪器获得尽可能好的图像。等离子体中产生的氧自由基氧化碳氢化合物，产生一氧化碳等物质₂， CO和H₂O通过真空系统移除。XEI Scientific进行了几项研究，表明Evactron可以有效去除碳氢化合物，这是通过使用先前受污染的石英晶体微天平确定清洁率的量化结果确定的。⁴等离子体清洗对优化生成3View数据集和后向散射探测器清洗的好处是目前的研究。

理论和背景

SBFSEM系统包括SEM、安装在显微镜室门内壁上的金刚石刀切片机以及控制采集过程的软件和硬件（Denk和Horstmann，2004）。为了在无需用户干预的情况下生成序列图像，将树脂嵌入样本切割并成像数千次。图1A展示了一个标准实验室配置的例子，在赫尔辛基大学生物技术研究所的FiangQuanga 250上有专用的3VIEW平台。图1b显示了3View切片机的特写图，该切片机包括左侧清晰位置的刀片和右侧发光的样品架。紧凑型Evactron EP等离子清洁器（图1c）可根据端口可用性安装在SEM室的不同位置，将离真空出口最远的端口视为最佳位置。图1d所示为碳氢化合物污染后向散射检测器示例，其显示出降低的信噪比和较差的对比度。

图1所示。硬件用于sbsem实验:a)典型的sbsem系统，b) Gatan 3View切片机的细节，c)安装在Zeiss Sigma SEM腔上的真空EP等离子体清洁器，d)受污染的背散射检测器。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

使用Sigma VP SEM（卡尔蔡司公司）和3View SBFSEM系统（Gatan公司）以及XEI Scientific Evactron EP去污器（图1c）进行实验。首先，在1-3kV、2000x放大倍数下对树脂嵌入的小鼠心肌标本进行成像。然后在30 kV下对样品进行10分钟的辐照，随后对样品进行成像，以检查胶体银区域的对比度损失以及机加工铝SBFSEM短柱上污染扫描矩形的形成。使用Gatan GMS 3.2软件，生成清洗前后Caco-2细胞上的胶体银涂料区域和幽门螺杆菌切片的图像对比直方图。为了消除样品、背散射检测器和腔室中的碳氢化合物污染，使用了20 W下5分钟和X5下2分钟的清洁配方。

结果

图2描绘了铝sbsem存根上的污染伪影(a, b)，在一次等离子清洗(c, d)后未检测到。在图3中，对相邻的胶体银dag区域进行比较，发现在一次等离子清洗周期后BSE对比增加了14%。测量重复三次，以确认结果的一致性。为了确保背向散射电子对探测器上的污染层更加敏感，使用了1.2 kV的低加速电压。当加速电压较低时，样品表面的充电和束损伤较小。

图2。在等离子体清洗(c,d)后，铝短节(a,b)表面没有污染伪影。

图3。在等离子体清洗sbsem样品周围的胶体银dag区域后，对比度增加了14%。

图4。对小鼠心脏组织块面进行等离子清洗前后20X扫描成像。

这些结果与发表在《Joubert》杂志上的数据令人满意地吻合⁵如图5所示。在这种情况下，对树脂包埋细胞的两幅图像的对比水平的分析显示，在3次清洗周期(每次6分钟)后，对比水平增加了15%。此类清洁协议通过提高图像对比度和信噪比，去除图像伪影和电荷，有助于获得准确的三维建模和sbsem数据集的比较形态分析。

图5。《Joubert》中的图像分析⁵表明血浆清洗后cACO-2细胞上幽门螺杆菌薄片的对比度增加15%。

泵停机时间的延长不仅延长了背散射探测器的寿命，还显示了FIBs和sem中碳氢化合物污染水平的依赖性。因此，这个时间可以作为真空系统清洁度的指标。以下数据表明，真空等离子体清洁器大大减少了sem和fib的泵停时间以及碳氢化合物污染，从而帮助增加了样品处理吞吐量，而不影响分析质量。

在下游或远程等离子体清洗中，形成氧自由基，以激发等离子体的形式填充真空室。在蒸发等离子体清洗中，空气用作工艺气体。在低压下，被激发的亚稳氮分子表现出流动的紫外余辉，具有典型的粉红色/紫色。等离子体流动紫外线余辉中中性自由基的浓度是等离子体中产生速率和中性余辉中损失速率的函数。

结论

在SBFSEM实验期间，将等离子体清洗作为常规操作，可以减少污染伪影和充电，提高图像质量，加快泵送速度，并在延长数据采集期间保持原始真空系统。随着扫描电子显微镜对延长操作时间的需求不断增加，保持真空室清洁的必要性也随之增加。SBFSEM系统必须全天候运行，最好保持在无污染状态下，图像质量不受影响。

当大块面树脂嵌入试样频繁成像时，烃类会被释放到真空室中，导致探测器效率降低。例如，为了确保快速成像的最佳条件，Zeiss MultiSEM 505配备了两个等离子体清洗机，以去除加载锁和主腔中的不稳定碳氢化合物。

当代的真空涡轮等离子™去污染采用温和的下游等离子体余辉工艺，消除FIB、SEM和其他分析工具中的碳氢化合物（HC）污染。蒸发清洗变得更快，并在涡轮泵压力下扩散到整个腔室。这归因于更长的平均自由程，在所需的三体碰撞中导致更少的氧自由基复合，并减少对室壁的散射。在大多数情况下，较短的等离子体清洗周期足以消除污染并显著减少泵停机时间，从而实现样本处理和分析的高通量。

真空系列等离子清洗机提供了快速，强大，有效的清洗范围广泛的压力，允许无伪，高质量的图像和提高样品分析效率。如果将等离子清洗包括在常规维护协议中，就有可能保持最佳的检测器性能。

参考文献和进一步阅读

1. Denk, W.和H. Horstmann (2004) PLoS Biol. 2,1900。
2. Leapman, R. et al.，(2016)显微和显微分析22 (supl . 3)， 1104。
3. 桥本，T. et al.，(2016)超微病理学163,6。
4. Vane, R和E. Kosmowska(2016)显微和显微分析22(增刊3)，46。
5. Joubert, L. M.(2013)显微镜与分析5月期，15。

本信息来源、审查和改编自XEI Scientific提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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