用在线粘度计测量聚合物，蛋白质

概括

在线粘度计测量与GPC偶联的聚合物、蛋白质和肽的内部粘度，以表征基本的物理化学性质，如摩尔质量、大小、构象和支化比的分布。

作为下一代粘度计的代表，ViscoStar III采用了多项技术创新，提供了更高的灵敏度和稳定性标准。本文描述了这些创新以及实施这些创新所带来的好处。

介绍

在表征聚合物时，在线粘度测定长期以来一直与凝胶渗透色谱（GPC）或尺寸排除色谱（SEC）一起使用。如图1所示，灵敏微分粘度计使用毛细管桥测量含有聚合物样品的溶液相对于溶剂粘度的小增量粘度。

该值表示为无单位的“特定粘度”η_{服务提供商}。其值除以浓度，由诸如Optilab T-Rex差分折射率（RI）检测器的在线浓度检测器确定，以计算本征聚合物粘度η。

当特性粘度（IV）被认为是聚合物的固有有价值的性质时，当与其他实验数据相结合时，它变得更加突出，例如用黎明Heleos II MALS检测器获取的多角度光散射（MAL）数据。

与浓度一起分析，MALS提供了分子量和大小的第一性原理分析，不需要参考标准品或柱保留体积。用MALS可以得出摩尔质量范围在200 Da到1 GDa之间。同时，可确定的均方根半径的大小范围在10 ~ 500 nm之间。

图2说明了基于柱校准的单检测器GPC可能产生不可靠的分子量结果，而MALS结果稳健且准确。

图1。微分粘度计中使用的毛细管桥。IP和DP是积分和差压传感器。通过调整电阻比R1/R3=R2/R4，电桥平衡（当纯溶剂流经所有四个电阻毛细管R1-R4时，DP=0）。当样品流经R1、R2和R4，同时延迟柱将溶剂输送至R3时，进行样品测量。比粘度计算如下：η._{服务提供商}= 2DP /（IP-4DP）。

由于同时MALS-IV计算产生多个样品性质，因此MALS和IV的共分析变得更相关，包括：

• Mark-Houwink-Sakurada参数
• 从1nm和Up和Up的流体动力学和均方根半径
• 构象（随机线圈，分枝，球状）
• 分枝比，每个分子的分枝数和排水系数

特别是如果它们是强烈的荧光，则一些聚合物对MALS分析没有响应。因为它们是指向溶剂（DN / DC = 0）或溶液是光学不透明的指标，所以这种聚合物散布弱。对于此类应用，可以在没有MAL的情况下使用在线粘合剂，以便通过以下通道表征分子量：

• 通用校准- 一种假设理想（空间）样本柱交互的技术。
• Mark-Houwink-Sakurada分析- 利用针对每个样品或溶剂组合单独确定的经验参数的技术。

无论使用的技术是否是SECMALS-IV或SEC-IV，内在粘度的清洁测量需要超过基本技术。

图2。29kDa聚苯乙烯标准的分子量单检测器GPC（蓝色）和MALS分析（红色）的比较。虽然MALS显示狭窄的分子量范围，但通过定义列校准意味着峰值是20-40kDa的多分散。

克服在线粘度赛的挑战

η的大小_{服务提供商}对于从GPC柱洗脱进行的低浓度聚合物，可以大约仅为每百万分之几（ppm），使差动粘度计高度敏感。

尽管如此，它必须同时对HPLC泵脉冲或室温变化产生的压力和温度波动，并且可以产生与样品相当的各种压力信号。差动粘度率的技术进步主要旨在提高克服环境噪声信号的样本灵敏度。

泵脉冲免疫

HPLC泵运营商了解定期压力脉冲在操作中很重要。这些脉冲通常是对折射率（RI）HPLC浓度探测器定量的最终限制因素，尽管预期精心设计的装置克服这种脉冲以及抑制低于PPM水平的光学响应。

然而，差分粘度计应该测量压力变化。因此，与其他类型的检测器相比，克服这种脉冲不太直接。通常，存在两层技术，用于解决脉冲的IV测量，桥梁平衡和电子平滑。

桥梁平衡

通常，新仪器的条件，一种理想平衡的毛细管桥，具有呈现相等的流量和体积的所有四个臂，原则上应完全缩短流速的任何波动。

然而，在实践中，由桥对称性产生的脉冲抵消效应将是显著的，但不完全，并且可能随溶剂粘度和流速而变化。由于老化和污染物在毛细血管壁上的累积，桥梁在一段时间内也会失去平衡。

是怎么做到的

为了克服平衡损失，工程师们探索了通过滑动密封自动机械调整毛细管R3长度的方法。当R1/R3=R2/R4时，桥接器将重新平衡。不幸的是，滑动密封件代表了可靠性链中的潜在薄弱环节，因为它们在侵蚀性有机溶剂下容易降解和泄漏。

在Viscostar III中

如美国专利7213439所述，电桥的热调谐采用非机械方法，通过调节调谐毛细管的温度来平衡毛细管电桥，从而有效地调节其电阻。

如图3所示，调优元素与R3相邻。在调谐期间，所需的流动相在GPC测量期间以相同的流速运行在整个仪器中。在调谐过程中(图4)，调谐毛细管的温度自动调整，以使DP信号为零，在0.001 psi内。

该图显示了约0.03的调节°C必须保持在0.0001 psi（0.7 pa）内的桥梁余额。考虑到仪器的整个热围栏被调节到0.005以内，这一要求易于实现。°C整个过程在10分钟内完成，完全可以每天重新平衡桥梁。这种活动是不可取的。

更好的反应是重新平衡溶剂或流速（如果保持相同的溶剂和流速，则每周一次）以确保最佳性能。由于热调谐能够迅速响应泄漏，因此可以建立Viscostar III作为下一代设备。

图3。在Viscostar III中的毛细管桥，实现R3的热调谐和用于完全阻抗匹配的脉冲补偿元件。

图4。热桥调谐只需10分钟，不需要过多的温度调节。黑色图表显示DP信号随调谐毛细管温度的变化。

脉冲补偿

实际上，没有理想的毛细管桥。桥梁第三臂中的延迟栏自然地产生体积不平衡，即使四个臂完全平衡抵抗。如果流量和压力是恒定的，则该体积不平衡并不存在问题。

然而，通过不等体积的压力脉冲的发展意味着它在其他毛细血管之后到达R3，最终表现出动态不平衡。因此，泵浦脉冲出现在IP信号中，特别是在超灵敏DP信号中。

是怎么做到的

虽然脉冲出现在IP信号中，但它们对整体特定粘度的影响很小。实际上，DP信号比这些脉冲更复杂且致力于。在过去几十年中使用的DP换能器是膜传感器。

这种换能器的传感膜有几秒钟的松弛时间，作为副作用，便于涂抹和隐藏泵脉冲的过程。同时，膜的长时间常数也扩大了色谱峰的后缘，导致分辨率损失。因此，上一代差示粘度计通常具有一般的色谱分辨率。

在Viscostar III中

粘星III带来了一个多层次的方法，目标是真正的脉冲补偿和滤波，相比之下，粗脉冲涂抹与峰加宽。

阻抗匹配

完全阻抗匹配是在硬件或流体水平引入的脉冲补偿中的第一个进步之一。为了通过延迟塔补偿脉冲传播不平衡，在桥的相对侧添加第二延迟体积。通过适当的匹配体积，在桥的左侧和右侧传播的脉冲同时到达DP换能器，然后抵消。

但对称性并不完美，如图5所示，阻抗匹配使DP脉冲降低了约100倍，而又不失色谱分辨率。补偿体积靠近传感器的位置意味着它不影响静态桥式平衡，样品不通过它，它不严重影响任何特定粘度的测量。

脉冲过滤

脉冲补偿中的第二个进步是软件中残留DP脉冲的匹配过滤。因为这些脉冲以固定间隔到达，所以很容易确定其频率或通过使用傅立叶滤波来移除它们。图5显示该算法消除了完全剩余的脉冲。

专有的计算

当脉冲从DP信号中消除后，IP中的小波动仍然会影响具体的粘度计算。第三项进步通过一种专有算法(美国专利7,331,218)消除了这些波动的影响，该算法利用基线IP值并在不参考瞬时IP信号的情况下计算sp。

集成在Viscostar III中的多层脉冲补偿技术可实现色谱质量和样本的更好的灵敏度，而不是系统性质。

图5。先进的脉冲补偿在DP传感器信号。第一层，通过补偿体积进行阻抗匹配，将脉冲振幅降低了约100倍。第二层，在软件中对泵浦频率进行滤波，消除残余脉冲。

热稳定性

热稳定性的基本元件是良好的被动隔离和用于调节和温度稳定性的有源热元件。在差动粘度计中，即使室温变化几度摄氏度，桥毛细管应保持在恒定温度约为0.01°C的恒定温度。因此，即使被动隔离处于高电平时，也需要主动热管理。

无源隔离

在设计良好的粘度计中，毛细管通过大型热沉彼此保持良好的热接触，但远离室温变化或仪器内的变化。前者通过将毛细管连接到单个金属块中来实现，而后者涉及在所有流体和传感器组件周围构建一个绝缘良好的盒子。

从热箱或良好的热接地上拆除任何部件，尤其是电桥或延迟柱，会使系统产生热漂移和传感器信号的相应基线漂移。ViscoStar III采用整体设计，保持最佳被动隔离，实施最佳工程实践。

积极调节

通常，被动隔离不足以实现高灵敏度。因此，需要具有反馈的有源元件。

它是如何完成的

一些仪器使用简单的加热元件，但这通常将热稳定范围限制在10°C高于室温或更高。单靠加热，仪器无法在室温下稳定。

更先进和创新的设备，如Viscostar II，采用热电珀耳帖的热调节。该机制使仪器能够加热或冷却。Peltier Crulation在室温下提供稳定性，降低可能需要蛋白质，肽或其他敏感样品所需的温度。

有源热调节的另一个方面是有源元件和温度传感器的数量，以及它们在热箱周围定位。该设计通常仅包括单个有源元素和一个或两个传感器。物理描述了从单个活性元素辐射出来的热梯度，最终将在仪器中发展。这种梯度应对某种程度的漂移负责。

在更大程度上，梯度可以通过严格的工程过程进行控制，但如果没有额外的活性元素，就无法完全克服。

在Viscostar III中

粘星III型采用了热工作台的双peltier分布式调节。如图6所示，这种设计允许在较宽的温度范围(4 - 70)进行主动控制°C)并消除热梯度是自然的单一元素设计。这导致更快的热平衡，更好地隔离室温波动，并减少热漂移。

图6。粘星III台的热调节利用两个Peltier单元来消除热梯度和伴随的信号漂移。

传感器的可靠性

在上一代粘度计中使用的DP传感器是非常敏感和脆弱的。超压和腐蚀被记录为这些仪器失效的主要原因。

过度压力

高流速、高溶剂粘度和堵塞油管的任何组合都可能导致压力过大。不同的方法已经进行，以保护DP传感器从破坏压力水平，可能破裂的膜。

它是如何完成的

在Viscostar II中实施的被动保护利用标准的HPLC背压调节器，以确保任何超过极限的系统压力都可以安全地转移到废物管线上。虽然这种方法是可靠的，但它无法有效地通知用户任何过压。如果样品被转移到浪费，则测量可能已损坏，但是没有关于此类事件的消息将转发给用户。

如果信号超过允许的值，可以通过两种方式进行另外的保护：通过监测DP信号或通过打开换能器吹扫阀来缓解过量压力。这些机制仅是部分解决方案，因为它们没有响应不产生差压信号的高系统压力。虽然DP传感器受到保护，但不一定解决其他敏感组件。

在Viscostar III中

具有有源传感器和系统保护意味着仪器的所有组件都被监控和保护免受过压。在Viscostar III中，内部传感器和有源释放阀更换了无源保护装置。当系统背压超过安全限制时，释放阀被电子激活以转移溶剂流，绕过桥梁，DP和IP换能器。

Viscostar III的系统压力传感器提供了可在各种时间段内访问的连续压力读数，以确定堵塞的积累或系统维护的任何需求。如果由于过压而被激活，则在通知之后用户可以促进诸如中止测量的补救措施。

Viscostar III设计必须依赖内部软件，包括“常开”阀门，可在仪器关闭时转移溶剂流动以绕过桥梁。因此，即使未使用设备，组件仍然完全受到保护。

腐蚀

用于差动粘度计的高灵敏度磁差压力传感器通常由410不锈钢焊接铬镍铁合金帽制成。410不锈钢材料，特别是它和英科乃尔之间的焊接接头，容易被含盐的水溶液腐蚀。正因为如此，在线粘度计在蛋白质应用或类似要求中至高盐或极端pH水平的设置中的使用受到限制。

它是如何完成的

减少腐蚀易感性的主要方法是从没有焊接接头的单个材料制造整个换能器;然而，磁性材料通常易于通过高盐缓冲液欧洲杯足球竞彩腐蚀。

另一种解决方案是用耐腐蚀材料(如PTFE3)在换能器的湿润部分进行布线。如果涂层不会降解，这种方法就会很有效。虽然这两种方法都提供了防腐保护，但解决腐蚀的更好方法是可用的。

在Viscostar III中

有效的传感器将没有腐蚀的湿润材料或关节，易腐蚀。欧洲杯足球竞彩ViscoStar III用压电换能器取代磁膜换能器，该压电换能器不需要磁性金属膜。在新的DP换能器中，所有湿润的表面都是316不锈钢（在大多数HPLC系统中发现的材料，即使在高盐浓度下也具有优异的耐腐蚀性）和PTFE。

vististar III的整个流体通道是为了消除所有易受腐蚀或恶劣有机溶剂损坏的材料而开发的。欧洲杯足球竞彩该仪器在各种水溶剂和有机溶剂中具有良好的溶剂相容性。

更多好处

与其他上一代设备相比，新的DP换能器承诺更优越于腐蚀。除此之外，该器件还具有比磁膜换能器更快的响应时间，这意味着在降低峰扩展的方面，可以满足先前提到的泵脉冲补偿的益处。

图7显示了压电电阻DP换能器的优势。例如，作为BSA单体和二聚体的秒的副产物的DP峰在Viscostar III中显着较大，而不是在上一代仪器中。由于先进的脉冲抑制技术，更快的DP传感器响应不会导致来自泵脉冲的信号波动。

图7。BSA单体和二聚体的色谱图，如前一代粘度计（红色）和Viscostar III（蓝色）的DP信号中所示。Viscostar III大大减少了先前世代的缓慢DP传感器诱导的人工频带扩展，允许在670秒处分离BSA二聚体。

下一代粘度计

在前几代的差动粘度计中，工程师们已经找到了解决一些关键挑战的方法。传统的仪器，尽管其可靠性值得怀疑，但运行起来很容易;然而，使用vististar III，可以实现更高标准的解决和消除技术难点。这一实现产生了具有更高灵敏度、稳定性和溶剂兼容性的下一代仪器。

动态范围、灵敏度和分辨率

动态范围定义为可测量的最大和最小信号的比值。它指示了所有可以分析的样品和条件。维斯科星II的动态范围超过35000:1，至少比其他同类仪器高出4倍。粘星III扩展其前身的范围超过135,000:1，使它，到目前为止，市场上最好的可用仪器。图8展示了大动态范围的一部分。

在图9中，提出的是各种浓度的环氧树脂的灵敏度和分辨率的改进。前一种（Viscostar II）和下一代（Viscostar III）装置的固有粘度测量值具有良好的质量，其中样品浓度相对较高，横跨主峰。

然而，在浓度低的情况下，例如在18至24分钟的前沿，Viscostar III测量提供了更强大的分析。事实上，Viscostar III的敏感性在仅0.05Pa，意味着它可以通过良好的保真度来注射仅0.1μg的100kDa聚苯乙烯。这比Viscostar II好三倍，比竞争粘度计好十倍。

图8。特性粘度测量的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和羧甲基纤维素，涵盖范围大。个位数的特性粘度也很容易测量。

溶剂的兼容性

分析仪器在各种条件和抗腐蚀的鲁棒性中需要多功能性。已显示Viscostar III抵抗困难的溶剂，例如：

• 四氢呋喃与10%甲酸
• 100毫米醋酸盐缓冲液，pH 3.5
• DMF，具有0.1％LIBL
• 1%醋酸+ 500 mM NaCl
• 800 ppm sds + 250 ppm nan_3.
• 100毫米Na₂SO4 + 250ppm NaN_3.

稳定

如图9所示的优异的内在粘度结果表明了稳定性Viscostar III贯穿整个过程。其他测试表明，与最终可能由空调循环造成的室温波动有良好的隔离。事实上，visstar III的基准漂移比其他同类仪器高出50倍，保证了在大范围下入或多次注入过程中高效稳定的性能。

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图9。环氧树脂的特性粘度。TOP：100μL注射，Viscostar II（蓝色）与Viscostar III（洋红色）;底部：12.5μL注射，Viscostar II（绿色）与Viscostar III（棕色）。虽然上一代粘度计(粘星II)和下一代粘度计(粘星III)的特征粘度结果在主要峰值上质量都很好，但当样品浓度较低时，新仪器的高信噪比和测量质量是显而易见的。

结论

作为下一代在线粘度计的代表，visstar III在性能和多功能性方面实现了重大飞跃。结合ASTRA和行业领先的DAWN HELEOS II MALS探测器和Optilab T-rEX折射率探测器的性能，粘星III是聚合物、多肽、蛋白质等最复杂GPC分析的首选粘度计。

本信息来源、审查和改编自惠悦科技提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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