食品蛋白粉的分类与鉴别

食物蛋白粉是由碳水化合物、脂肪和蛋白质组成的复杂混合物。即使是同一种蛋白粉，根据其来源和提取/分离过程，其营养和加工特性也会有所不同。快速分类特定类型蛋白粉的能力，以区分供应商之间名义上相似的蛋白质，并评估批次之间的差异，对于许多食品制造商实现一致的产品质量是非常重要的。

任何蛋白质最重要的特征之一就是它的二级结构，以依赖于主肽键中羰基氧和胺氢原子之间氢键模式的局部结构构象为代表。长期以来，FTIR被认为是蛋白质二级结构表征的可行分析方法。通过酰胺I波段(~1650 cm)的曲线拟合或反褶积，可以估计不同二级结构的贡献^－1)，由蛋白质酰胺基的C=O伸缩振动引起，^1，2提供重要的蛋白质结构特征，如构象和稳定性。^{1、2、3、4、5所示}

然而，众所周知，曲线拟合策略依赖于纯蛋白质的二级结构(α-螺旋和β-薄片)的带分配。因此，尽管这种方法成功地表征了分离的单个蛋白质，但对于蛋白质粉等复杂混合物的分析还不是最理想的，因为多种蛋白质和非蛋白质材料之间的相互作用会影响酰胺I区(1700-1600厘米)的光谱特征欧洲杯足球竞彩^－1）⁶．

本文介绍了基于傅里叶变换红外光谱和主成分分析(PCA)相结合对食品蛋白粉进行分类和鉴别的可行性。通过选择正确的光谱范围进行主成分分析，可以成功地评估不同种类的蛋白粉、来自不同供应商的相同蛋白粉和/或不同批次的蛋白粉的总体组成和蛋白质二级结构的异同。

实验

来自不同供应商的豌豆、大米、牛奶和乳清蛋白粉样品可供分析。如表1所示，供应商来源的数量从5个(乳清蛋白)到1个(牛奶蛋白)不等，单个供应商的批次数量从3个到1个不等。

表1。用FTIR光谱法测定蛋白粉样品

蛋白粉	供应商	的数量很多	样品
牛奶	一个	3.	A1, A2, A3
豌豆	B C D E	2 2 1 1	B1、B2 C1, C2 D1 E1
大米	F G H	2 1 1	F1, F2 G1 H1
乳清	我 J K l 米	2 3. 2 2 2	I1、I2 j - 1: J2, J3 K1, K2 L1, L2 M1, M2

采用衰减全反射(ATR)模式测量了蛋白粉的光谱Thermo Scientific™Nicolet™iS50 FTIR光谱仪它利用了单片金刚石晶体。每次测量时，在金刚石ATR晶体上保留少量蛋白粉。使用附件的压力塔保证了粉末与金刚石晶体之间良好的接触。每个样品的三个子样品以4厘米的分辨率测量^－1和512扫描。

采用氮气净化Nicolet iS50光谱仪，以避免水蒸气对光谱的影响。数据采集后，Thermo Scientific™OMNIC™软件的高级atr校正功能应用于所有光谱。本文给出的结果是三个子样本的平均值。Thermo Scientific™TQ Analyst™软件用于进行主成分分析，进行光谱评价，进行表征和分类。

结果与讨论

蛋白粉光谱

每种蛋白质类型的代表性光谱如图1A所示。牛奶蛋白粉只有一家供应商提供，但该产品的批次与批次的重复性可以在图1B中观察到。在图1C-E中，对来自不同供应商的其余蛋白质类型样品的代表性光谱进行了分类。在酰胺I区(1700-1600厘米)，各种蛋白质类型之间都有明显的差异^－1)和酰胺II区(1580-1510厘米^－1)，因为它们的二级结构不同。乳清蛋白谱组(图1E)的供应商间差异最大;相比之下，豌豆蛋白谱组(图1C)最小。

此外，还可以看到由非蛋白成分引起的变异。例如，碳水化合物的峰值在1080厘米左右^－1在每个蛋白质组中都有很大的差异。另一个例子，脂质峰在~1743厘米^－1不同的样本也不同。虽然在牛奶蛋白样品中脂质峰特征很弱(图1B)，但在豌豆蛋白光谱(图1C)、大米蛋白光谱(图1D)和乳清蛋白光谱(图1E)中脂质峰特征很明显，且强度不同。

图1所示。(A)蛋白粉全尺寸atr校正光谱

图1所示。(B)一个牛奶蛋白供应商的三个批次的光谱;(C)三种不同供应商的豌豆蛋白粉光谱;(D)三种不同供应商的大米蛋白粉光谱;(E) 5个不同供应商的乳清蛋白粉光谱。

使用总体中红外区域的主成分分析分类

主成分分析是一种统计方法，主要用于从光谱定标集获得显著方差。主成分分析(PCA)利用光谱计算从光谱方差建模的因素。第一个因素在数据集中有最大的方差，而在与前一个因素正交的条件下，每个后续因素又有最大的可能方差。线性组合因子重建校准集的每个单独光谱是可能的。每个因素的系数，也称为“分数”，可以在主成分分析空间中绘制，以勾勒出光谱之间的相似和/或差异。因此，具有数千个波长值的光谱可以被最小化到二维或三维空间中的单个数据点，这与使用前两个或前三个因素有效地建模总体方差的条件有关。

在进行主成分分析之前，对atr校正的蛋白光谱进行了许多预处理。利用二阶导数进行光谱预处理，然后对光谱进行标准正态变量(SNV)校正，以补偿ATR晶体上不同堆积密度带来的强度变化。为了提取最有意义的变化，只使用相关的光谱区域进行分析。这里，整个中红外光谱范围为4000-500厘米^－1，除了2356-1900厘米的地区^－1与钻石ATR测量相结合，用于PCA。图2表示得到的得分图。

图2。蛋白质粉样品的主成分得分图使用了大部分的中红外区域。

从图2可以看出，只使用了两个主成分(PCs)来实现对各种蛋白质类型的有效分类。每一种蛋白质类型在PC空间中聚集到自己的结构域。每个蛋白质组内的变异可以通过对图2中的聚类进行更仔细的检查来揭示。来自同一供应商的数据点，如牛奶蛋白的A1、A2和A3，乳清蛋白的I1和I2，都是紧密聚类的，这表明每个供应商生产的产品具有标称差异的可重复过程。

然而，不同供应商之间的差异通常更明确。例如，供应商J、K和M似乎生产类似的乳清蛋白粉，而供应商L和我生产的乳清蛋白产品却截然不同。来自L供应商的乳清蛋白(图1E中的绿色痕量)的光谱在1080厘米处有相当大的吸光度^－1这表明该产品中碳水化合物含量较高。

以大米蛋白粉为例，来自不同供应商的数据点比较分散。以豌豆蛋白粉为例，产品B与产品D相似，产品C与产品E相似，但两个簇之间的距离较远。需要注意的是，上面解释的主成分分析是基于总的中红外光谱范围，因此方差包括了蛋白质和非蛋白质组分的贡献。

酰胺I区分析

为了直接比较产品中的蛋白质，只进行了基于酰胺I光谱区域的PCA。选择酰胺I光谱区域是因为它是特定于蛋白质的二级结构。图3显示了所有产品的光谱的酰胺I区，其中酰胺I波段的形状因产品和供应商而不同。

图3。蛋白粉在酰胺I光谱区(1700-1600厘米)的全尺寸、atr校正光谱^－1)显示每种蛋白质类型的光谱，从每个供应商来源。由于只有一个奶粉供应商的样品，这个地块包括三个不同的批次。

图4给出了对应的PCA评分结果。各种蛋白质类型的一般分组类似于图2中的全范围PCA评分图。每种蛋白质类型都在自己的结构域内聚集;然而，与图2所示的全范围PCA模型相比，分组有点紧。这一观察证实了图2中所显示的变化当然包括蛋白质和非蛋白质的贡献。供应商L提供的乳清蛋白就是一个相关的例子。在全范围PCA模型(图2)中，来自供应商L的数据点(L1和L2)远离包括供应商J、K和M的集群，但在当前的模型中，它们更接近(图4)。

可以合理地得出结论，L厂商生产的乳清蛋白粉与J、K、M厂商生产的乳清蛋白粉主要是非蛋白质含量不同。另一方面，在两种PCA模型中，vendor I的产品与其他乳清蛋白粉都有明显的不同，说明样品I与剩余乳清蛋白的差异至少在一定程度上是由蛋白质构象的差异造成的。图3证实了这一观察结果，与剩余的乳清蛋白相比，微量I1明显不同。

图4。使用酰胺I(1700-1600厘米)测定蛋白粉样品的主成分得分图^－1)地区。

结论

本文表明了两者的结合红外光谱和主成分分析是对不同食品蛋白粉进行分类和鉴别的有效工具。总的中红外光谱范围可以很容易地观察到非蛋白组分导致的厂商配方差异，作为分类和鉴别的依据。仅基于酰胺I区PCA模型的分值图明显反映了蛋白质二级结构的差异。

虽然基于酰胺区域的PCA模型不太容易受到非蛋白变异的影响，但它仍然有效地对每种蛋白质类型进行分类，并区分来自不同供应商的产品。这两种模型都使FTIR能够根据产品类型、供应商来源和重复性对蛋白粉进行分类和区分。除了简单和容易，实验消除了样品制备的需要。一些食品制造商可以很容易地采用来料检验和QA/QC方法。

参考资料及进一步阅读

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2. 黄志刚，李志刚，李志刚。基于傅里叶变换红外光谱的蛋白质二级结构的研究。生物化学学报(1986)25,469-487。
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4. Suja Sukumaran, FTIR分析蛋白质二级结构，Thermo Fisher科学应用笔记AN52985。
5. 傅里叶变换红外光谱技术在蛋白质结构测定中的应用。学生物化学启。摩尔。杂志。(1995) 95 - 120。
6. 陈志强，陈志强，陈志强。基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR FTIR)分析蛋白质结构的研究，应用光谱学(2018)第72卷(2)第268-279页。

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