外泌体特征的综合观点

总结

外泌体的特性已经成为医学研究和分子生物学的一个有趣的话题。这篇文章包含了Wyatt Eclipse如何^®场流分馏系统结合多角度光散射(MALS)和动态光散射(DLS)设备，可以对外泌体进行更详细和完整的表征。2020欧洲杯下注官网

这是通过从生物基质的其他组分（如血清、尿液等）物理分离外显体，然后在线测定电荷、大小和组成来实现的。可以分离部分以进行进一步的离线分析，特别是外显体中所含DNA的测序。

最近发表在《自然生物学》上等研究表明，生物功能与大小相对应，使用该方法首次可以分离出三个不同大小的种群怀亚特Eclipse FFF系统. 本文解释了如何实现外显体的分离，以及通过在线结合DLS和MALS可以获得哪些信息。

介绍

根据最近的研究，外泌体是特定疾病生物标志物的一个独特来源。大小范围为30-100纳米的未受影响和疾病影响的细胞释放外泌体和小泡，所有其他细胞都是如此。然而，微囊泡通常直径为100-1000纳米，并以不同的方式从起源细胞释放出来。

图1所示。细胞外小体的分泌及其作为生物标志物的意义．一个)外泌体的生物发生从多泡内体，而微泡是通过膜出芽从细胞表面释放。b)外泌体和微泡都含有跨膜蛋白、胞内蛋白、DNA、RNA和miRNA，这些都是潜在的生物标志物。c)外泌体存在于所有体液中。图(2)。

外泌体来源于活性细胞，如活性肿瘤细胞，而微泡主要来源于死亡细胞的气泡，不能反映活性疾病状态，因此对生物标记物的兴趣较小。外质体具有双重脂质层，包含DNA、RNA、miRNA、可溶性和跨膜蛋白质，反映了细胞的生物学功能。

为了使用外泌体作为生物标志物的来源，它们必须从微泡和可溶性高丰度蛋白中分离出来。大量外泌体通常采用非特异性方法收集，如超离心或沉淀。

FFF是选择的方法，因为它在1-1000 nm范围内的尺寸分离非常有效。张等已经证明了FFF在从其他材料中分离外泌体的独特能力，并将外泌体分离成具有不同性质和生物标志物的三个不同群体。

油田流体分馏是如何进行的

样品被注入一个底部有多孔壁的薄带状通道中。一些通过通道流向出口的水流穿过多孔的底部，形成交叉流。由于横流作用，摩擦力使试样向堆积壁集中，而布朗运动则起到反作用力。

分子不断地远离底部壁，但又被从上面推回来。这就产生了一种粒子云，其浓度随着离底壁的距离呈指数级下降，就像空气压力随着离海平面的距离下降一样。不欧洲杯猜球平台同粒径的颗粒到堆积壁的中间距离不同，由其扩散系数给出。

图2。Flow-FFF分离原理。如图所示是沿着通道堆积壁移动的两个粒子云，该堆积壁由一块由熔块支撑的膜组成。横流从顶部来，并渗透过堆积壁，对颗粒施加摩擦力。欧洲杯猜球平台相对于较大的(蓝色)粒子，较小的(红色欧洲杯猜球平台)粒子在交叉流中扩散得更高。通道流的抛物型速度流廓线输运的颗粒云越长，输运速度越快，而大颗粒的颗粒云越紧。欧洲杯猜球平台

颗粒越小，扩散系数欧洲杯猜球平台越大，因此在通道中越高，颗粒越大反之亦然．靠近堆积壁的最大浓度区域与不存在分子的通道之间的距离小于10µm。通道的平均高度为350µm，意味着样品在整个分离过程中都保持在靠近底壁的位置。

随着离堆积壁距离的欧洲杯猜球平台增加，层流速度变大，越小的颗粒越快地通过通道向出口移动。因此，颗粒按大欧洲杯猜球平台小分离，颗粒越小洗脱越快(图2)。FFF理论得到了很好的解释，给出了定量描述保留的方程，如下图所示。

在维_t扩散系数是V吗_x和V_c横流和槽流率分别为t_R为测量的保持时间，w为通道高度。

童子军DPS^®软件根据这个方程预测实验结果。

欧洲杯足球竞彩材料和方法

外泌体的分离使用Eclipse AF4系统和Agilent 1260高效液相色谱，并配备了馏分收集器。一个黎明^®与怀亚特凯尔斯™ 安装在探测器12上用于MALS和DLS检测。使用ChemStation的Eclipse插件执行仪器控制。一份单独的协议交换文件中描述了详细的实验协议。[4]使用短通道和标准流量程序实现分离，在45分钟内将交叉流量从0.5 ml/min逐渐降低到0。

数据处理

数据处理使用ASTRA进行^®，具有将多角度光散射（MALS）和动态光散射（DLS）结合在单个封装中的独特能力。

为什么MALS和DLS合并？

这两种光散射技术都可以测量纳米颗粒的大小，并且具有很强的互补性。MALS测定的均方根半径在10 ~ 500 nm之间，灵敏度约为DLS的20倍;DLS测定的流体动力学半径在0.5 ~ 200 nm之间，其上限由流速确定。MALS和DLS的结合表明了其形状和结构。

可选的DLS模块可以整合到DAWN中，利用相同的流池和激光，使其非常多功能。

图3。模拟的分馏结果与实验结果相比较。图中显示的是半径为10、20和50纳米的三种粒子混合后的断口图的理论计算。欧洲杯猜球平台下面是实验结果。它非常接近预测，除了更宽的峰为10 nm粒子首先洗脱。原因是，这个粒子不是理论计算中假设的单分散。

结果与讨论

在他们发表于《自然细胞生物学》的论文《通过不对称流场-流分馏鉴定不同的纳米颗粒和细胞外囊泡亚群》中，Zhang说欧洲杯猜球平台等发现所有的外泌体并不具有相同的本质。

使用FFF-MALS-DLS在美国，他们发现了三种不同类型的细胞外小泡，被称为Exo-L、Exo-S和Exomeres。Exo-L是直径在90 - 120nm之间的大型外泌体囊泡，Exo-S是直径在60 - 80nm之间的较小的外泌体囊泡，而外泌体是直径在35nm左右的非膜性颗粒。欧洲杯猜球平台

除了膜的大小和存在之外，其他生物物理特性也区分了这些类型，包括N-糖基化程度、蛋白质含量、代谢物含量、DNA/RNA图谱和功能。然而，这些类型在大多数细胞系中是保守的，这表明它们是具有不同来源和功能的生物纳米颗粒的独立分类。

图4。FFF-MALS-DLS分离和表征外泌体。三重组合允许对这些生物纳米颗粒进行独特的表征和理解。串联使用MAL和DLS扩展了尺寸测量范围，根据最近公布的结果，这已被证明是至关重要的。欧洲杯猜球平台

结论和展望

FFF-MALS-DLS是一个多样化、准确和强大的平台，用于分离和表征外泌体和其他纳米颗粒。欧洲杯猜球平台它支持在线检测器，如UV/Vis，荧光，吸收，质谱，差示折射通过光学实验室^®，以及光散射探测器。

电非对称流场流分馏(EAF4)是一项新技术，使用Mobility™系统根据粒径和电荷分离颗粒。欧洲杯猜球平台迁移系统还可以确定zeta电位，从而提供完整、详细的尺寸与zeta电位的分布。

Zhang的论文并不是第一个使用Eclipse/DAWN系统的论文，因为Yang之前也使用过相同的设置等为了确定一个潜在的救命生物标志物，健康人群的尿外泌体与前列腺癌患者的尿外泌体在大小上存在显著差异。其他利用FFF-MALS-DLS描述外泌体特征的出版物也有类似的重要发现。

参考文献

1. 张辉等(2018)“通过不对称流场-流分馏鉴定不同的纳米颗粒和细胞外囊泡亚群”，Na欧洲杯猜球平台t. Cell Bio. 20, 332-343页DOI: 10.1038/s41556-018-0040-4
2. Sitar S. et al. (2015)“非对称流场-流分馏法测定外泌体的大小和定量”，肛门。化学。87,pp. 9225-9233 DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01636
3. Petersen k.e et al. (2014)“利用AF4-UV-MALS-DLSTEM对B16-F10小鼠黑色素瘤外泌体分离技术和特性的综述”，Anal。Bioanal。化学。406，页7855-7866 DOI: 10.1007/s00216-014-8040-0
4. Zhang H.和Lyden D. (2018)“细胞外小泡的非对称流场流分馏(AF4)的协议”，协议交换，2018年2月19日，DOI: 10.1038/protex.2018.002
5. 杨建生等(2017)Flow Field-Flow馏份和Nanoflow液相色谱-串联质谱法分析前列腺癌患者尿外泌体的大小依赖脂质组学，肛门。化学。89，页。2488-2496 DOI: 10.1021/acs.analchem.6b04634
6. Agarwal K.等人(2015)“外泌体释放作为MAPK途径抑制的细胞反应的分析”，Langmuir 31(19)， 5440-5448页DOI: 10.1021/acs.langmuir.5b00095
7. Ashames A.（2015）“利用场流分馏技术开发分离方法以产生均匀的外质体亚群”，博士。论文科罗拉多矿业学院内政部：http://hdl.handle.net/11124/17052
8. Kang D.等人（2008），“通过流场流动分馏和纳米流液相色谱-串联质谱法对人类神经干细胞外体进行蛋白质组学分析”，J.蛋白质组学研究7 pp.3475-3480 DOI:10.1021/pr800225z

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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