简化实验涉及CLEM荧光显微镜

相关光和电子显微镜(CLEM)是一个健壮的方法研究细胞过程的超微结构水平。西科姆平台,开发的一种荧光显微镜结合扫描电子显微镜,可以简化实验涉及CLEM通过提供一个完全自动化的叠加过程和荧光之间的平滑切换和电子显微镜。

图片来源:伤风/ Vshivkova

挑战

然而,样品制备,仍然是任何实验的核心。达到理想的叠加精度,最好获得荧光以及电子图像在同一resin-embedded部分[1,2]。这产生了一个困难与样品制备。幸运的是,样品制备的最新进展已经导致了一系列的协议表明树脂荧光的荧光蛋白[1 - 5]。

两项研究显示,成像GFP和YFP在真空中有大量对荧光强度的影响。[3]:“首先,我们观察到的荧光强度下降的真空压力减少由于提取的水样本,并再度发行水进入系统可以抵消部分真空压力或大气压力。第二,我们表明,尽管荧光强度降低的分压200 Pa(创建使用水蒸汽),FP强度是非常稳定和耐光漂白成像。最后,我们表明,控股IRF部分真空导致荧光的很小的损失。”

实验

在这种情况下,京都海拉细胞被使用,稳定表达GalNAC-T2-GFP和组蛋白2 b-mcherry。细胞生长在碳涂层蓝宝石磁盘和冻结在高压力。然后,细胞被冻结取代glass-distilled UA 0.1%丙酮(有些改变[2]和[6])和渗透Lowicryl HM20。

成像是利用来实现的西科姆平台40 x / 0.95 NA目标,安装在Verios 460 l SEM(范)。荧光激发竣工使用“Pinkel”配置多频带滤波器组和领导激励的474和554海里GFP mCherry,分别。

sCMOS相机是用于收集图片。进行了扫描电镜成像的加速电压3 kV通过使用列探测器(ICD)。

图1所示。结果

引用

1. Peddie c J。枯萎病,K。威尔逊E。米利亚,C。Marrison, J。Carzaniga, R。、Domart M.-C。O ' toole, P。拉里贾尼,B。&歌l . m .相关和综合树脂GFP荧光光和电子显微镜,用于集中在哺乳动物细胞甘油二酯。Ultramicroscopy3 - 14,143年,2014年。
2. Kukulski, W。Schorb, M。、Welsch年代。山顶,。Kaksonen, M。和布里格斯,j . a .相关荧光和3 d电子显微镜具有灵敏度高、空间精度。《细胞生物学》杂志上192(1),111 - 119年,2011年。
3. Brama E。、Peddie c J。琼斯,m . L。Domart, m . C。Snetkov X。,,M。拉里贾尼,B。&歌l . m .标准荧光蛋白作为二重形式在一个集成的光探测器的相关实验和电子显微镜。化学生物学》杂志上,2015年。
4. 约翰逊,E。Seiradake E。琼斯,e . Y。戴维斯分校。Grunewald, K。& Kaufmann r相关树脂超分辨率和电子显微镜使用标准的荧光蛋白。科学报告5、9583、2015。
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6. Avinoam, O。Schorb, M。、Beese c J。布里格斯,j . A。、& Kaksonen m内吞作用的连续弯曲和重塑网站成熟的网格蛋白的外套。欧洲杯线上买球348(6241),1369 - 1372年,2015年。

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