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光学显微镜提供的图像分辨率受到主要物理定律的限制，这些定律统称为衍射极限。
为了克服这一限制，科学家们创造了强大的超分辨率显微镜方法。这些过程对不兼容电子或原子力显微镜的标本特别有用;比如细胞结构和其他高度敏感的生物标本。
随着超分辨率技术的发展，它们在广泛的应用中变得更加友好。一些功能性超分辨率方法已经发展起来，以解决速度和光毒性问题，使它们适合于活细胞成像研究。
因此，当需要高分辨率时，功能性超分辨率技术已成为生物成像技术的主要选择。有两个重要的类别涉及各种超分辨率战术下降:确定性和随机。
泛函超分辨率的主要方法包括对衍射受限的发射器(如单荧光分子)的坐标进行定位，拟合它们的点扩散函数(PSF)，并使用这些定位来生成样本的详细图像。
随机超分辨率策略通过一系列荧光团的激活和失活来确定单个分子的位置。当逐点获取图像时，这个系统要重复数千次。光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)是由这一过程定义的两种随机方法。
确定性超分辨率方法，如受激发射耗尽(STED)和基态耗尽(GSD)，利用对激发光的光学反应来增强分辨率。这些策略可用于成像10纳米以下的结构，在适当的成像条件下提供高度的一致性。然而，由于它们通常需要使用复杂的硬件、独特的荧光团和成像缓冲器，许多传统成像研究无法实现确定性方法。
超分辨率的其他好处
除了能够看到以前看不见的结构外，超分辨率还带来了其他一些好处。
高速算法允许超高分辨率图片可以看到现场。在图形处理的改进已经删除的时间分辨率的障碍，从而可以实时超高分辨率实现的。
超分辨率显微镜还提供了额外的光学深度，使研究亚细胞结构和力学在纳米尺度。科学家们不仅可以清楚地观察样本的外部，还可以清楚地观察到细胞样本内部100微米的深处。
这些成像解决方案可用于在延时成像中获得全面的三维超分辨率图像信息，因为其具有更高的时间分辨率。
使用超分辨率的问题
尽管其巨大的力量和潜力，有与超分辨率显微镜一些固有的困难，其中许多变得更糟分辨率变得更大。
一个重要的问题是收益递减:随着超分辨率系统解决的特性越来越小，可反应的荧光色素的数量越来越少，这就需要创造出具有更大量子产率的新荧光色素。超分辨率图片的等级也会有很大的变化;用同样的技术拍摄的照片可能看起来非常不同。
此外，由于激发强度高或曝光时间长，一些活标本比其他标本更容易受到超分辨率成像的负面影响。施加在样品上的压力也会对信息的可靠性产生影响，这可能会掩盖更高分辨率的优势。
光学像差是超分辨率的另一个问题。折射率的变化对光的光学性质有相当大的影响。正确使用浸没油，以正确匹配的折射率，活和固定的标本是必不可少的，以获得最高的可能的分辨率。
当实验室权衡利弊时，他们应该考虑自己的特殊需求，并研究所有的超分辨率解决方案。最好的选择是在提供所有所需信息的同时产生最有用的荧光发射的技术。
随着技术的进步，光学和计算机超分辨率的解决方案正在团结起来，在商业成像仪器，多功能的报价，能够生成图像超出衍射极限的多模系统。一些成像系统具有共焦和超分辨率模式。这些系统让操作上，将提供最好的结果给定的应用模式决定。用相同的滑动，研究者可以共焦和超高分辨率模式之间切换，产生两个不同的数据集。这额外的好处允许数据，可导致确凿性发现和更大的确定性的不同来源。
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