生物材料的样品制备-从细胞破碎到均质和粉碎欧洲杯足球竞彩

生物样本有各种形状和大小，例如，坚韧的纤维植物、坚硬的骨头、柔软的肌肉、坚韧的黏性痰液、肿瘤或肝组织。此外，还有数以百万计的细胞状细菌、酵母或藻类，在提取蛋白质或RNA或DNA等应用中，它们必须被破坏。

由于样品制备是每个分析过程的首要步骤，所有类型的生物样品都必须为代谢组学、基因组学或转录组学的研究准备。RETSCH提供了一系列的研磨机和研磨机，用于固体样品材料的简单和可重复的粉碎，其中一些也是理想的细胞破碎和生物样品材料的均质。欧洲杯足球竞彩

在本文中，RETSCH mills的使用描述了以下应用:

• 微藻、酵母和细菌的细胞破坏(悬浮)
• 低温研磨松针、细胞丸和肌肉组织
• 硬、软生物样品(如肝、痰)均质
• 从受感染的人体组织中获得完整的细菌细胞的清洗过程
• 粉碎法医样本，头发，牙齿和骨头

微藻、细菌和酵母的细胞破坏(悬浮)

基础生物学研究、医学研究或应用生物技术的一个标准程序是对酵母、细菌、微藻或丝状真菌进行细胞破坏，以获得细胞蛋白质、代谢物或核酸(DNA、RNA)。不同的细胞破坏技术可以在实验室规模上使用，一般可以分为使用化学物质破坏细胞膜和结构的技术，以及机械方法。

利用机械方法，可以打破芽孢杆菌孢子和分枝杆菌细胞等难以溶解的厚细胞壁。不需要添加可能影响后续萃取步骤的化学物质。

打珠是一种广泛使用的、有效的、直接的细胞分裂机械方法，涉及陶瓷、钢铁或玻璃制成的珠子。通过摇动或搅拌使小球与细胞悬浮液完全混合;由于玻璃微珠的大表面积，剪切力打破细胞壁，导致细胞组分的释放。虽然珠打法通常用于2毫升一次性小瓶中的小型细胞破碎，但也可用于更大的小瓶，如50毫升一次性Falcon试管。

与其他机械方法(如超声波法)相比，这种方法的优点包括在一个步骤中处理各种样品的可能性，而不存在交叉污染的风险，易于使用，并且细胞成分的收率更高。最直接的打珠技术是将细胞悬浮液与等量的珠子混合，在实验室的涡流搅拌器的帮助下进行搅拌。

然而，这种技术易于出错，特别是时间密集，特别是对于高达10分钟或高样品吞吐量的细胞中断时间。该过程可以快速，可重复和高效使用RETSCH的密炼机MM 400结合各种适配器。由于细胞是自动破碎的，操作人员可以节省时间，可以用于分析过程的进一步步骤。

一般情况下，分离DNA或RNA所需的细胞材料少于1ml，因此细胞破坏主要使用1.5 ml或2ml Eppendorf进行^®管。RETSCH为这些小瓶提供不同的适配器，从而使多达20个样品在一个步骤中处理。然而，为了提取代谢物或蛋白质，需要更多的细胞悬液，因此建议在50毫升一次性管中进行细胞破碎(Falcon^®管);MM 400可用于同时处理8个样品(8个样品的30毫升细胞悬液或，如果需要，240毫升细胞悬液分成8个锥形离心管随后的细胞悬液池)。目前，缺失的尺寸在2毫升和50毫升之间的管可与新的5毫升Eppendorf^®管，这也可以与MM 400使用。

案例研究：酿酒酵母细胞破坏酿酒酵母

为了研究，例如细胞蛋白的功能，必须打乱大约30毫升细胞悬液的体积。使用搅拌机MM 400和锥形离心管适配器(同时8个样品)的自动化过程与手动细胞破坏的涡旋器进行了比较。为了获得足够的蛋白质产量，将4克酵母细胞与16克玻璃珠(0.5-0.75 mm)和12克破碎缓冲液在50毫升试管中漩涡，需要12 × 1分钟，中间在冰上冷却1分钟。

同时破坏两个以上的样本只能通过使几个人连续一些涡旋工作来执行。此外，它有义务在运营商之间交换样本来弥补硬件特定的以及特定于用户特定的差异。

通过使用混合器轧机MM 400，大大简化了实验室工作。该磨机可用于自动破坏多达30Hz的频率的各种细胞悬架样本。可以减少细胞破坏至7分钟的时间，以实现12分钟后与涡旋相比的均匀蛋白质产量（图1）。使用MM 400的自动化过程的另一个益处是细胞破坏时细胞悬浮液中的温度的最小增加，并且改善的再现性（图2和3）。

图1所示。使用旋涡仪和混合器MM 400对细胞进行破坏后的总蛋白浓度。所需的蛋白质产量是在7分钟(MM 400)后达到的，而旋转需要12分钟。

图2。在MM 400（30Hz）中或用涡旋中的细胞破坏期间温度升高，在细胞破裂的每分钟后在冰上冷却。

图3。增加细胞破坏后总蛋白质浓度的再现性，在mm 400，12分钟内涡旋7分钟;误差栏：％标准偏差。

通过改变球的大小和振荡频率，优化了酵母细胞的破碎。提取蛋白时，将提取速度降低到20 Hz，有利于总蛋白含量略有增加，起泡少。此外，与30 Hz相比，20 Hz时的温度升高幅度更小(图4)。

图4。温度增加，7分钟毫米400，20或30 Hz，冰上没有中间冷却。

当使用0.75-1.00 mm大小的玻璃珠而不是0.5-0.75 mm大小的玻璃珠，并将质量增加到24 g时，细胞破碎的结果有微小的改善(图5)。

图5。mm400细胞破坏的优化。使用0.75到1毫米大小的小球，蛋白质浓度最高(左图);蛋白质浓度受珠数的影响(右图)。

在另一种方法中，用mm400进行酵母细胞破坏的过程与超声进行了比较。此外，还比较了50ml锥形离心管和2ml一次性离心管中细胞破裂后的蛋白浓度。5分钟后，用打珠法实现的蛋白产量几乎是用超声法实现的6倍(结果未显示)。25ml细胞悬液(离心管)和1ml细胞悬液(2ml管)之间的差异不显著。

自动细胞分裂过程明显优于其他技术，如超声或手动涡旋已被清楚地证明。该技术允许同时处理多个样品，提供了高的蛋白质产量，保持细胞悬液的温度在可容忍的限度内，并具有良好的重现性。

案例研究：微藻细胞破坏

微藻(如硅藻)的细胞破坏可能是困难的，因为细胞往往反对玻璃珠产生的剪切作用。在过去，用玻璃珠和摇床一起成功地进行硅藻细胞分裂是不可能的，通常使用的是法压机。当与其他激振器相比混合机MM 400，再加上锥形离心管的适配器，最适合有效地破坏微藻细胞。

将拟南大虾(Thalassiosira pseudonana)的细胞悬液约300 ml离心，在20 ml破碎缓冲液中重新悬浮，并填充到50 ml锥形离心管中;加入40 ml玻璃微珠(90-150 μm和300-400 μm，比例1:1)，在20 Hz下进行细胞破碎20秒。使用显微镜可以观察到细胞的完全破坏(图6)。

图6。使用混合器MM 400结合管适配器对50 mL管进行分裂前(左)和分裂后(右)的地中海硅藻细胞;20秒，20赫兹。

MM 400甚至可以实现对藻类细胞的完全破坏Phaeodactylum tricornutum，它很容易对抗由于缺少硅酸盐细胞壁而产生的剪切效应。将200 ml的细胞培养液离心，重新悬浮于20 ml破碎缓冲液中，转移到50 ml锥形管中。加入40 ml (90-150 μm和300-400 μm，比例1:1)的玻璃微珠，在30 Hz下3 × 60秒内进行细胞破碎。共3min后，显微镜下未见完整细胞(图7)。

图7。混合机MM 400结合锥形离心管适配器对三角褐指菌细胞分裂前后(左)和(中)和(右)细胞进行细胞分离;3 x 60秒，30赫兹。

与使用法式压力机涉及的技术相比，使用MM 400的珠子跳动过程较少耗时，因为可以同时破坏八个样品，并且横污染的风险最小化。使用MM 400而不是其他振动器是推荐的，因为它产生了足够强的剪切力，以有效地破坏那些通常反对通过珠跳动中断的细胞。

肝脏或痰等强硬和软生物样品的均质化

有时，生物样品的制备和均质过程可能与材料本身一样坚韧。通常使用的2ml单次使用管通常不够大，不能容纳整个样品体积;因此，必须按照均质过程对样品进行分离和团聚，这意味着在实验室常规中执行额外的耗时工作步骤。尽管有更大尺寸的研磨罐——例如不锈钢制成的——可以容纳整个样品体积，但它们的缺点是在使用后必须清洗。

这个问题的理想解决方案是新的5毫升一次性管，不需要清洗。RETSCH开发了一种新的适配器，用于混合器Mill MM 400，容纳5毫升管，从而允许在同一时间制备10 x 5毫升的样品。

生物样本的性质可能会有很大的不同，例如囊性纤维化患者的非常坚硬的痰或组织样本，如肺、肝或肿瘤。下文描述了将MM 400与用于5毫升一次性试管的新适配器结合使用，以均匀化这些样品。

图8。适配器MM 400容纳5个5毫升管。

案例研究：囊性纤维化患者非常坚硬痰的均质化

囊性纤维化患者咳出的痰经常被匀浆用于常规诊断和研究。使用MM 400混合器可方便地均质痰样;然而，由于过去使用了2ml小瓶，因此处理每个痰样本超过1ml是不可行的。由于痰是一种部分感染性物质，将粘稠、坚硬的痰分成几份进行均质处理是不合适的。另一种选择是使用5ml不锈钢研磨罐，这需要细致的清洗。5毫升反应管的新适配器提供了更高的体积和一次性小瓶的综合优势。

在试验过程中，使用两到三个氧化锆磨球（Ø5 mm）在30 Hz下均匀化多达3 ml，持续时间约2.5分钟。可在5毫升试管中一步处理整个样品，减少工作量并节省时间；它还将潜在传染性物质的处理降至最低。

案例研究:肝组织均质化

在生物基础研究、生物医学、分子诊断、毒理学、药理学等许多领域，肝脏、肺或肿瘤等组织样本都是常规研究的对象。用户在这里面临的挑战类似于痰的匀浆。因此，新的5毫升一次性使用管连同混合机MM 400也是一种有效的均质化解决方案，甚至适用于此应用程序。为了使肝脏均质，研究了研磨球的数量、大小和样品体积的某些组合，结果表明，少量10毫米的研磨球比少量更小的研磨球具有更好的缩小组织结构的效果。

使用三个10 mm不锈钢研磨球可获得最佳结果，可彻底均匀化3 g新鲜肝组织。将含水缓冲液注入反应瓶中，直至达到最大填充线。然后，将样品在30 Hz下均匀化5分钟，并且在处理后无法观察到组织残留物（图9）。使用以下参数可以在锥形离心管中实现相同程度的均匀化：15 g样品、四个不锈钢球（20 mm）、30 Hz、缓冲液、3分钟。研磨球/样品/缓冲液的重量限制了使用离心管一次只能处理两个样品的数量。在这两种情况下，温度的升高都是微不足道的。

图9。在MM 400中均质化之前和之后的肝脏样品。

细胞颗粒、肌肉组织和松针的低温研磨

没有缓冲液，可以粉碎坚韧，柔软和纤维的生物样品。对于诸如欧洲杯足球竞彩非常坚韧的静脉或指甲，纤维植物或不同种类的动物或肿瘤组织的材料，缓冲系统中的均质化不是很有效。然而，低温研磨 - 也就是说，在研磨之前或期间，使用干冰或液氮的样品的脆性 - 已被证明是获取均匀粉碎样品的理想方法。

与打珠过程相反，在粉碎前冷冻样品的技术也适用于裂解细胞内细胞器，例如酵母。低温研磨的另一个好处是极低的温度，这可以防止蛋白质的降解，或者显著减少研磨时挥发性成分的损失。对于粘稠的样品，如浆果(图11)，低温研磨通常是生产均匀样品的唯一技术。表1概述了通过使用搅拌机MM 400或CryoM欧洲杯足球竞彩ill低温研磨成功粉碎的样品材料。

表1。通过用液氮的低温研磨粉碎的不同的生物样品

样本	配件	饲料数量	研磨时间	速度	最后细度(d90) /结果
大肠杆菌	2砂罐不锈钢50毫升 每罐25毫米不锈钢研磨球2个	2 x 10 ml冷冻细胞颗粒	2分钟	30赫兹	完整的细胞破坏
肌肉组织	研磨罐不锈钢50毫升 研磨球为25mm不锈钢	10克	4分钟	25 Hz.	<150μm.
松针	2个适配器10个2毫升反应小瓶 每个小瓶2个5 mm不锈钢球	每瓶2针	3分钟	30赫兹	一次可重复提取20个样品的RNA
浆果	研磨罐不锈钢50毫升 4 x研磨球不锈钢15毫米	2克	40秒	20赫兹	< 200μm
指甲	适配器冷冻4 x 2 ml小瓶 4磨砂球不锈钢5毫米/瓶	每个小瓶1手指钉	2分钟	25 Hz.	< 200μm
大鼠肠道	研磨罐不锈钢35毫升 1 x不锈钢研磨球20毫米	1.8克	2分钟	30赫兹	<150μm.

图10。肉片在低温研磨前后。

图11。低温研磨前后的粘稠浆果。

图12。低温粉碎前后的松针(包括用于RNA分离的琼脂糖凝胶，粉碎后制备的RNA具有良好的重现性和数量)。

适合低温研磨的实验室研磨机

搅拌机MM 400或CryoMill（图13）可以有效地用于粉碎小样本量。适当的研磨罐的MM 400由PTFE或钢制成;也可以使用1.5或2毫升的单用小瓶。必须注意确保液氮未在研磨罐或管内封闭，因为由研磨过程产生的热量转动液氮（LN₂)气体，导致研磨罐内压力过高。

用大钳将封闭的研磨罐放入充满液氮的绝缘容器中2-3分钟后夹入MM 400中。由于高能输入和随之而来的摩擦热，必须确保磨削过程不超过3分钟，以防止试样升温并保持其断裂性能。如果需要更长的研磨时间，应对封闭的研磨罐进行中间冷却，以中断这些工作。

图13。50升杜瓦。

RETSCH创建了CryoMill作为MM 400的一个进步，提供了用液氮不断冷却研磨罐的好处，即使在漫长的研磨过程中，也能保持样品和研磨罐的温度在−196°C。如果需要中间冷却，可以对磨削和冷却的周期进行编程。

由于磨瓶在整个过程中都停留在磨机中，用户在任何时候都不会接触到液氮，所以CryoMill的操作是非常安全的。自动预冷却功能保证磨削过程不会在达到和保持−196°C的温度之前开始。氧化锆研磨罐可与冷冻研磨机一起使用，进行无重金属研磨。

法医样品粉碎：头发、牙齿和骨骼

象头发、牙齿和骨头欧洲杯足球竞彩这样的法医材料通常是易碎的，因此在粉碎之前通常不需要冷却。根据所需的分析细度，样品可能需要在切削磨或颚式破碎机中进行初步破碎，以产生足够小的颗粒尺寸，以便在球磨机中进行进一步处理(<10 mm)。对于预先切割的骨头，可能是新鲜的，因此没有完全干燥(甚至可能有肉残留)，切割磨坊被使用。

RETSCH提供一个完整的系列切割机(图14)用于硬、软、有弹性、纤维状和中硬样品材料的初次尺寸缩减。欧洲杯足球竞彩广泛的附件阵列允许完美的适应一系列的应用。装备……是可能的SM 300带有三个不同的转子和底部筛网，孔径从0.25到20毫米不等。与新鲜和脂肪骨头相比，它甚至可以通过一到两个步骤将干骨头的大小减少到<0.25毫米。为了使最佳适应有关温度敏感性和断裂行为的样品特性，SM 300提供了100-3000分钟的变速^－1并且坚固足以研磨甚至坚韧的骨头。

图14。RETSCH提供不同类型的切削机。

应用实例的骨头

在这个例子中，700g骨头使用sm300预粉碎，结合一个6盘转子和一个孔径为6mm的底部筛子。骨头在3000分钟时被压碎^－1在30秒内，导致小于6毫米的件（图15）。

图15。在sm300切削机上研磨前后的骨样本。

磨碎牙齿或骨头通常是在球米尔斯使用由氧化锆、钢或碳化钨制成的>5毫米大小的研磨球。大的研磨球有足够的粉碎能力，通过冲击粉碎这些非常硬的样品。在上面的例子中，预先粉碎的骨头使用搅拌机MM 400粉碎;取1克样品装入35ml氧化锆研磨瓶中，用20mm氧化锆研磨球进行精细研磨。

在30 Hz下进行2分钟，将样品粉碎成小于200µm的颗粒，即可用于核酸的提取。欧洲杯猜球平台当试样非常坚硬时，可通过液氮脆化来改善试样的断裂行为。

应用实例的牙齿

另一个例子是牙齿的尺寸减小。将一片牙齿添加到25 ml氧化锆研磨罐中，并使用尺寸为20 mm且由相同材料制成的研磨球进行研磨。在MM 400中以30 Hz的频率处理3分钟后，样品已变成粉末，大多数颗粒测量值小于100μm（图16，右图）。欧洲杯猜球平台

图16。磨前和磨后的牙齿在MM 400搅拌机中。

应用实例的头发

专门为低温研磨而设计的CryoMill和MM 400也可用于研磨纤维样品，如头发。令人惊讶的是，非常健康的头发必须在低温条件下磨碎;相反，不健康的头发可以在室温下磨碎，因为它更容易折断。与非常致密的牙齿或骨骼相比，用较小的磨球磨头发更合适，因为这一过程需要摩擦而不需要冲击。要注意研磨时间，研磨时间要尽可能短，因为样品容易烧坏。例如，在一个25毫升的不锈钢研磨罐中加入1克头发，其中包括6个直径10毫米的不锈钢球。在25 Hz下磨2分钟后，样品被磨成小于160µm(图17，右)，适用于药物控制等分析。

图17。人发前后在MM 400中细磨。

来自RETSCH的磨粉机非常适合粉碎不同类型的法医样品，用于分析或提取核酸。此外，通过预先切割和精细研磨两步就可以很容易地制备更大的样品，如完整的骨骼。

从人体组织中获得完整细菌细胞的洗涤程序

人工关节置换(如膝关节或肘关节)后可能发生感染:与关节置换相关的主要风险之一是由不同种类的细菌引起的所谓假体关节感染(PJI)。例如，在假体关节感染的情况下，必须在不破坏组织样本的情况下清洗掉组织样本上的细菌，然后再培养它们，以达到诊断目的。

当前报告的PJI率在2％的范围内，在手术室，预防性抗生素，手术技术以及仔细选择其他因素的患者方面，仍然存在相当多的感染年。PJI可能在手术程序后三天内发生;但是，它也可能需要数年才能爆发。由于PJI是由相当不同的微生物引起的，因此对定性疗法进行分类是复杂的。

不幸的是，基于所采用的技术，记录率是有限的——在某些情况下，不可能使用传统方法记录感染。密炼机MM 400在这里有一个作用。步骤很简单:用20毫升无菌除盐水稀释样品，将样品放在一个高压罐中，罐中有5毫升直径1毫米的玻璃珠。也可以使用在30赫兹下搅拌3.5分钟的一次性罐子。在这个过程中，微生物从样品中被洗掉而不被破坏，使它们可以很容易地在琼脂平板上复制。使用这种方法可以获得良好的文档率(a.l。Roux et al 2010)¹. 基本上，它可以用于任何固体感染组织样本，而不管是否存在植入材料。

搅拌机轧机MM 400:一个真正的多用途实验室轧机

以上讨论的所有应用示例均表明，由于配件种类繁多，RETSCH的MM 400混炼机用途广泛。它最适合一次性使用的小瓶中的细胞破坏，例如，50毫升锥形离心管或更小的反应小瓶（0.2/1.5/2/5毫升）。MM 400适用于研磨或粉碎各种硬、脆、软、纤维、半硬或弹性材料，如骨骼、植物、细胞组织、松针、医药产品、矿物、羽毛、木材或化学品。以30 Hz的最大频率运行，可产生5μm以下的研磨尺寸。欧洲杯足球竞彩

图18。带8 x 50 ml锥形离心管适配器的400 MM混炼机（下图）和各种附件，例如一次性反应瓶适配器（左）、研磨罐和研磨球（右）。

结论

从珠打细胞通过均质和粉碎到低温研磨，RETSCH为诊断、生物技术、微生物学、农业和法医等领域的样品制备提供可靠和方便的解决方案。

参考资料及进一步阅读

1. A.-L。鲁克斯，V.西瓦顿-塔迪，T.鲍尔，A.洛塔特-雅各布，j - l。赫曼,J.-L。Gaillard和M. Rottman:通过假体周围标本的珠磨处理诊断假体关节感染;临床微生物学与感染，2010，欧洲临床微生物学与传染病学会，CMI, 17, 445-450。

此信息来源于RETSCH GmbH提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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