如何确定n -乙酰- dl -蛋氨酸水解反应动力学

生物依靠一种叫做酶的蛋白质来催化重要的有机反应来维持生命。这些反应开始于衬底(年代)对酶的逆转束缚(E)形成酶-底物复合物的活性位点(学位)速率常数k₁和k_－１．在下一步，产品(P)以速率常数k₂．¹通过以下等式表示酶催化的反应的一般反应方案：

为了更好地了解酶的行为，有必要对酶的活性进行动力学描述。Michaelis-Menten模型²是最着名的酶动力学模型之一。该模型由Michaelis-Menten方程定义，其涉及反应速率ν（或形成的形成率[P]）浓度的基材[年代]：

使用Michaelis-Menten模型，可以确定两个关键参数 - V_最大限度和K_米．V._最大限度为饱和底物浓度下的最大产物生成速率，测量酶催化潜能的效率。^3.米歇里斯常数(K_米)为反应速率为V的一半的底物浓度_最大限度并且该值通常用于评估活性位点对基材的亲和力（K_米值与亲和度成反比)。

一般来说，k_米和V_最大限度是通过测定酶在几种不同底物浓度下的初始反应速率来确定的。然后，反应速率与浓度成正比，形成米切里斯-门腾图。V_最大限度和K_米可以通过往复运动在Michaelis-Menten图上的两个轴上来源于Lineweaver-Burk图的最佳拟合线。

这个实验改编自奥尔森和贾尔斯的一篇文章，⁴酶解在哪里N-乙酰- l-蛋氨酸(N-酰基- l-氨基酸酰胺水解酶)。可以使用¹H NMR光谱与nmready-60.．从单一反应中获得的数据随后可用于构建Michaelis-Menten图和Lineweaver-Burk图，用于快速和半定量酶动力学分析。

过程

准备股票解决方案

再加上0.112克KH₂阿宝₄，0.382克N-乙酰- dl -蛋氨酸悬浮于2 mL的D中₂O. 2 M氢氧化钠溶液₂o小心地添加以使用pH纸将pH改为7。然后，D.₂o用于将所得溶液稀释至体积烧瓶中的5ml。最终解决方案包含400毫米N-acetyl-DL-methionine。猪酰化酶(10mg)和CoCl₂.6H₂将O（1.5mg）溶解在10毫升D中₂o准备酶的储备溶液。

使用NMReady-60监控反应

¹获得H NMR频谱（光谱中心= 5ppm，光谱宽度= 20 ppm，扫描数量= 16，点数= 4096，通过传输来延迟= 0.5秒）N- 乙酰-DL-甲硫氨酸溶液（500μl）至NMR管;将100μl酶溶液加入NMR管中并剧烈混合以引发反应。nmready-60上的动力学模块（群集= 40的数量，等待类型=线性，等待时间（tau）= 160，等待单位=秒）用于记录a¹H NMR谱每4分钟2小时。通过测量反应物α-甲胺质子的积分来监测反应的进程(N-乙酰- dl -蛋氨酸，4.25 ppm)和产物(l-蛋氨酸，3.85 ppm)。

结果

的¹H NMR核磁共振光谱的水解反应如图1所示衬底的损耗N-acetyl-DL-methionine (4.25 ppm),和产品的同时出现L-methionine”而不是“1 H NMR谱的水解反应如图1说明了衬底的损耗,产物l -蛋氨酸(3.85 ppm)的同时出现N-Cetyl-DL-甲硫氨酸（4.25ppm）。重要的是，如果外消旋混合物的D-映体保留在溶液中的D-映体，则4.25ppm的信号不会完全消失，而不用猪酰基酶水解。““重要的是要注意4.25ppm的信号并不完全消失，这是由于溶液中残留的D-映体存在，因为它不能通过猪酰化酶水解。

图1．堆积图¹猪酰化酶水解n -乙酰- dl -蛋氨酸生产l-蛋氨酸的核磁共振氢谱。

图2显示了底物浓度随时间变化的曲线。观察到底物浓度在一小时内达到一个平台，这个平台表示反应完成。反应速率随底物浓度的变化如图3所示为米克利斯-曼腾图。通常，Michaelis-Menten实验是通过测量多个初始底物浓度下的反应速率来进行的;然而，在这种情况下，实验被浓缩成一个单一的反应。

图2．底物浓度随反应时间的变化曲线。

图3．米凯利斯-门腾反应图。数据拟合为V = (V_最大限度[s]）/（k_米+ [S])。

随着反应的进行，会出现倍数¹获得了核磁共振氢谱，可以从每个谱确定底物浓度，并通过评估已知时间间隔内底物浓度的差异来近似反应速率。因此，在较高的底物浓度下，可以观察到反应速率开始达到一个平台，代表V_最大限度在该底物浓度下。

图4所示的Lineweaver-Burk地块是由Michaelis-Menten图通过两个轴的往复构造而成的。因此,K_米为0.24 mol/L, V_最大限度- 0.3152 mmol L⁻¹第二个⁻¹．

图4。反应的线织-伯克图。数据安装在等式1 / v =（k_米/ V_最大限度[s]）+ 1 / v_最大限度k的值_米（0.24 mol / l）和v_最大限度（0.3152 mmol l⁻¹第二个⁻¹)提取。

结论

该实验分析了酶水解N-acetyl-L-methionine。由于底物和产物中α-甲胺质子的化学位移的变化，使其成为可能¹H核磁共振光谱学用NMReady-60仪器跟踪反应进程。此外，从光谱中获得的定量数据用于构建Michaelis-Menten图和Lineweaver-Burk图，随后用于确定V_最大限度和K_米酶促反应的值。

数据的可访问性

NMREADY-60使得能够直接处理数据并打印。还可以将数据直接导出到USB或网络文件，在那里可以使用第三方NMR处理软件进行操作。

参考资料和进一步阅读

1. Le h;Algaze,美国;Tan, E. Michaelis-Menten Kineticshttps://chem.libretexts.org/Textbook_Maps/Biological_Chemistry/Catalysts/Enzymatic_Kinetics/Michaelis-Menten_Kinetics（访问2018年12月4日）。
2. 比安科,a;医学生物化学;学术出版社:英国伦敦2017年;第153-175页。
3. Berg, j .;Tymoczko, j .;路博,l .生物化学;5日ed。w·h·弗里曼公司:纽约，2002年．
4. 奥尔森,IR。，Olsen, J. and Giles, G. “An Enzyme Kinetics Experiment for the Undergraduate Organic Chemistry Laboratory.”j .化学建造．，2010，87.(9), pp.956 - 957。

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