共焦显微镜-如何工作

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共聚焦激光扫描显微镜(CLSMs)使用激光产生给定样品的数字图像。共聚焦显微镜与“荧光标记”协同工作，“荧光标记”包括改变特定的细胞特征，从而产生特定颜色的荧光蛋白。这使得观察者可以看到被研究的样品的特定部分，不同于传统的广域显微镜或电子显微镜，使用不同颜色的荧光标记更好地区分细胞或样品超微结构中的不同结构。

荧光标记

首先，普通的共聚焦显微镜依赖于彩色荧光蛋白的使用，它可以编码到生物体或细胞中的特定基因中。这一过程被称为荧光标记。在此基础上，有针对性的激光束被用来激发荧光蛋白，这些荧光蛋白将被标记到观察下的样本的目标部分。值得注意的是，样品的多个部分通常会被荧光蛋白标记。这意味着多重结构将吸收来自激光束的光子。

这些荧光分子吸收靶向光子束 - 该激发束导致靶向分子荧光。发出的荧光灯从二色（或二色）镜子中折射，然后是几个其他镜子，然后将该光正确聚焦到针孔孔中。这是至关重要的，因为它允许仅通过光电倍增管在数字显示器中感知和记录在目标焦平面中的光。

光电倍增管

光电倍增管，顾名思义，通过一个覆盖着保护玻璃屏的光电阴极来感知产生的荧光信号。然后通过一组阳极和dynode来放大入射光子，这些阳极和dynode将光子沿管的长度反弹，放大信号，并允许PC程序记录下来。

针孔光学筛选

针孔光学筛分技术的使用允许荧光发射的焦平面以外被选择出来，因此确保了高质量的，大聚焦的图像生成。这种数字渲染因此没有视觉噪声和模糊，这是由非聚焦光造成的，否则也会被吸收。

缺点是在标准的共聚焦显微镜中需要很长时间才能生成完整的图像。由于只使用了一个针孔，图像必须逐点、逐像素地构造。这意味着不同于标准的模拟显示，产生的数字图像需要时间来建立。这个问题可以在一定程度上通过使用两种技术之一来解决。

样品形貌的优点

首先，一些研究人员倾向于使用CLSM，它用一个声光偏转器(AOD)取代一个内镜，以控制样品荧光发射的光束方向。这使得比使用显微镜腔内的标准镜更精确的定位。

也可以利用适合于旋转盘技术的CLSM。在标准的共聚焦显微镜中，只有一个针孔孔径存在来检测来自样品的聚焦荧光束。然而，旋转圆盘显微镜使用了数千个针孔。这允许图像以数字格式快速呈现。

制作令人惊叹的二维和三维图像的关键也是共聚焦显微镜的最大优势之一。与传统的宽视野显微镜不同，CLSMs非常适合用于较厚的标本，例如苍蝇胚胎和肌肉活检。

通过采用样品层的序贯扫描，可以呈现复杂和高度聚焦的3-D。除此之外，不同颜色的荧光蛋白标签的应用允许特定特征的结构唯一阐明。然后可以彼此相对于彼此进行这些图像以产生高度详细的整个结构3-D可视化。

资料来源及进一步阅读

• 围场,美国(2000年)。激光扫描共聚焦显微镜的原理与实践。分子生物技术, 16(2), - 150页。
• 牛津仪器。(2019)。旋转圆盘共聚焦显微镜概述- Andor学习中心．(在线)可以在:https://andor.oxinst.com/learning/view/article/spinning-disk-confocal
• 牛津仪器。(2019)。共聚焦显微镜对活细胞成像的好处- Andor学习中心．(在线)可以在:https://andor.oxinst.com/learning/view/article/benefits-of-confocal-microscopy-for-live-cell-imaging.
• Sharedresources.fredhutch.org。(2019)。共聚焦和荧光显微镜共享资源|弗雷德·哈钦森癌症研究中心．(在线)可以在:https://sharedresources.fredhutch.org/services/confocal-and-fluorescence-microscopy
• Micro.magnet.fsu.edu。(2019)。分子表达显微镜引物：光学显微镜中的数字成像 - 数字成像 - 光电倍增管的概念．(在线)可以在:https://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/concepts/photomultipliers.html

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