使用现场流分馏以获得高分辨率分布的纳米粒子尺寸和Zeta电位

在这次采访中，Christoph Johann，Ph.D.从Wyatt技术谈到使用现场流分馏来获得纳米粒子尺寸和Zeta电位的高分辨率分布。

你能在FFF上给一些背景吗？

FFF已经存在很长时间了，并且越来越被接受。这促使ISO发布了一项名为“纳米技术——使用不对称流和离心场流分馏分析纳米物体”的新标准。这是使FFF成为可接受的标准化方法的一大步，可与SEC相比。

尽管如此，FFF仍然是不易使用和需要专家来充分利用它的声誉。我在这里谈谈更广泛用户群的FFF的全新的开发。它是新仪器加上复杂软件的组合。它提供了一组关于复杂样本的全面数据，没有其他单一方法可以提供。

当你谈论一个复杂的样本时，你的意思是什么？

复杂样品是指不均匀的，但由不同大小和性质的不同组分组成的样品，其中至少有一个是纳米颗粒。

它们覆盖尺寸范围从几纳米到围绕微米，它们可以在几何形状，化学成分和结构中不同。这些类型的纳米颗粒中的每一个通常具有尺寸和结构分布。欧洲杯猜球平台

一旦你加入其他大分子化合物，如蛋白质或聚合物，你就会得到一个大小和形状各异的动物园，所有这些都在一个样本中。

许多应用，包括基因递送，癌症疫苗接种，药物递送以及复杂的工业应用全部取决于复杂的样品。分析变得具有挑战性，传统方法无法提供所需信息以优化合成，并了解产品的工作方式，或者为什么不按预期工作。

是什么让fff是复杂样本的首选方法？

尺寸是纳米材料最重要的特性，这使得它们不同于较小的分子。欧洲杯足球竞彩为了说明我们所讨论的内容，首先考虑肽，这是相当小的，容易被高效液相色谱分离。然后，我们有一个抗体，更大，但仍然在一个大小范围内，可以很好地表征色谱柱，如HPLC或SEC柱。

当我们将其与病毒进行比较时，会有明显的大小差异，列可能不是描述它们的最佳方法，因此我们需要其他方法。这就是FFF发挥作用的地方，因为它可以在同一样本中分离这些大型结构，以及较小的结构，如抗体或肽。

FFF在其他分离方法上有哪些优点？

FFF根据尺寸物理地将样品分开，此外，可以收集馏分。与动态光散射相比，它具有高分辨率，以及宽分离范围，并且这种组合使其成为复杂样品的强大。它温和，具有低剪切力，因此是非破坏性的。

FFF可以在线耦合到多角光散射（MAL），其提供绝对的摩尔质量和洗脱级分的尺寸。凭借我们的新发展，我们可以使用电气/流FFF确定充电和充电分布，简单升级到现有的Eclipse FFF系统。

您的新发展如何使FFF更容易和更强大？

我们集中了三个特点：无缝集成和自动化的系统;扩展数据处理能力提供摩尔质量，尺寸，形状，构象，加电荷和电荷分布;和软件支持的方法开发。

流动fff的操作方法是什么？

将样品注入薄，带状的通道中，该通道具有多孔底壁。穿过通道的一部分流向出口的流动穿过底部，产生交叉流量。这种交叉流量将样品朝向所谓的积聚壁，底壁集中。布朗运动充当反作用力，抵御积累。因此，分子不断地远离底壁，由布朗运动驱动，但它们将从上面推回上横流。在静止平衡中，这产生了一种粒子云，其具有浓度的指数降低，作为距离底壁的距离的函数。

每个粒径将具有与累积壁的平均距离不同，由其扩散系数确定。具有较高扩散的较小欧洲杯猜球平台颗粒在通道中将升高，另一种方式更大，颗粒更大，将保持靠近堆积壁。

沿着通道的层流会产生一个不同的流速，这个流速取决于与壁面的距离。较小的粒子运动更快，将首先欧洲杯猜球平台洗脱，然后是较大的粒子，导致分离。

如何使用多角度光散射（MAL）获得摩尔质量和半径？

激光束穿过溶液流经的细胞。光与样品中的电子的相互作用产生散射光，这是由探测器测量的。它们被放置在散射中心的周围，在我们的仪器中，我们有3,8，或18个探测器可以测量从200克/摩尔到10克/摩尔的摩尔质量^9.G / Mol，尺寸测量从10nm至500nm的半径。具有较少角度的仪器在这些范围内具有较低的上限。

散射强度与摩尔质量和浓度成比例，并且从角度的强度降低，我们可以使用基本物理方程提取尺寸。

为了计算摩尔质量和尺寸，散射强度除以每个角度的浓度，并且数据由软件适合。从回归线的截距来看，我们得到摩尔质量，从斜坡上，我们可以计算平均方形半径。所有MALS测量的结果是摩尔质量和各个切片的尺寸。

您如何开发系统设置以允许新的和缺乏经验的用户操作系统？

这是我们称之为愿景的新软件平台。它将完整的工作流程从方法开发中集成到最终结果。所有应用程序都从本集线器启动。这包括Voyager，它是用于运行实验和SCOUT的软件，用于方法开发和用于数据处理。

开发侦察员的方法有四个步骤。首先，我们定义了一种代表我们样品的系列或一组尺寸，加上温度和溶剂。如果要运行电/流量FFF，我们还可以考虑粒子的电泳移动性。

第二步骤是选择诸如SEC信道或更长的信道和间隔物的频道几何体。

第三步是开发流程，直到我们有令人满意的分离。最后一步是将该方法导出到航行员并运行它。

模拟如何与真实实验相比？

在我们自己的例子中，协议非常出色，保留时间完美匹配。我们认为，与模拟相比，较早的尺寸尺寸的峰值峰值更广泛。也就是说，模拟假设单分散样品，而是从实验中的分数形状的形状，我们看到尺寸分布，并且MALS确认观察。

侦察员如何在运行后优化实验？

让我们在我们之前的实验中说我们希望增加两个峰之间的分辨率。它们不是完全基线分开，因此我们使用Scout运行不同的横流梯度，并预测它们将如何影响我们的压力线。我们发现改进分离的三种变化：减少初始交叉流动，在较长的时间内降低，然后在梯度末端保持更高的交叉流动。侦察兵预测，两种后期洗脱峰值将超过与此方法分开的基线。

同样，这是对模拟和实验的比较，并且在模拟和实验之间存在良好的匹配。因此，模拟真的很有用，让我们实现我们渴望的结果。

校准是可以计算FFF保留时间的尺寸分布之前的一个重要步骤。你的系统中如何完成？

校准频道参数的模拟可以通过两种方式进行。假设FFF理论完全适用于我们的样本，我们只使用一个参数，有效通道高度。第二个选项正在运行一组校准标准。Scout允许使用两个方案，并可以比较产生的大小分布。

您是否能够追踪此FFF系统中的性能？

所有的数据和系统轨迹都保存在数据文件中，可以使用SCOUT进行查看和比较，以验证实验的有效性。

Eclipse仪器的交叉流量非常高，这对于高精度测量至关重要。如果出现问题，系统参数迹线的曲线允许我们一目了然地识别可能的问题或异常值。

从Eclipse FFF实验中可以识别出哪些关键参数?

根据MALS得到的绝对摩尔质量和尺寸，可以从保留时间得到水动力半径。此外，通过增加电场，我们可以确定电泳迁移率值，然后可以转换为zeta电位。电导率，pH值和温度是实时测量并提供数据跟踪。

您提到将电气场应用于频道？这是如何用于确定电泳移动性的？

我们称这种方法电气/流fff。通过向流量FFF通道添加两个电极，我们能够施加与交叉流平行的电场。通过单独将样品聚焦在横流之后，我们在洗脱步骤中添加电压，其中发生分离。两个场叠加和具有电荷的样品的保留时间将改变。从保留时间的转变，计算电泳迁移率是直接的。

如果我们选择该领域的极性，使得我们对堆积壁具有吸引力，这是颗粒上的负电荷和积聚壁上的正电荷，然后保留时间将与电场强度成比例地增加。

如果我们有两个相反的电荷，我们将看到一个部分移动到缩短保留时间，并且相反的电荷移动到更长的保留时间。如果我们在几个实验中应用一系列增加的电场强度，则保留时间将与电场强度成比例地增加。

我们可以同时计算样品中的几个组件上的电荷。这是一种能力，原则上的批量测量不用使用光散射的传统Zeta电位测量。

如何使用分数来获取有关蛋白质的信息？

蛋白质电荷取决于构象，当然是pH或离子强度等溶液条件。我们可以使用EAF4，电/不对称流场流动分馏，以极少的努力测量蛋白质的负荷。

我们还具有前景的首要结果，表明我们可以使用EAF4测量的充电，作为鉴定抗体上的应力的参数，这在不一定地在变化的摩尔质量中看到。

关于Christoph Johann Ph.D.

Christoph Johann博士是Wyatt Technology Europe GmbH的创始人，并且在20多年内积极参与聚合物，生物聚合物和蛋白质分析。

他于1985年在大学的1985年赢得了博士学位。同年，他是PSS聚合物标准服务GmbH的联合创始人，该公司提供了用于研究目的的型号聚合物和开发的SEC柱。

1993年，他留下了PSS，并创立了第二家公司Wyatt Technology Deutschland，现在称为Wyatt技术欧洲。该公司已在制药行业中的多角光散射的增殖发展。