共焦拉曼成像获得的图像为微米空间分辨率的样品提供了信息。这些图像基于分子结构，对化学和物理性质的微小变化非常敏感。
此外，共焦拉曼成像促进了半透明，非混浊样品中的地下特征的非破坏性分析（取决于光学性质，这可以高达几百微米）。在没有需要横截面或暴露样品的内部的情况下进行该过程。可以通过在样本内的不同深度收集的拉曼图像的整理产生三维化学图像。
在使用标准（冶金）显微镜目的的样品中，可以通过从样品中的图像收集图像来引入在表面分析期间不遇到的性因子和结果降低的因素。当光通过具有大于空气的折射率的材料时，近轴光从轴偏光（球面像差）不同N> 1）。
如图1所示，由于这种球形像差而模糊，焦点模糊，并且这种效果随着进入样品的增加而升级。由于实际采样深度的这种失真，3-D图像由于这种失真而出现沿Z（焦点）轴压缩。另外，焦点的扩展也导致空间分辨率和拉曼强度的损失。
图1。(a)以空气作为物镜和焦点之间的中间介质，对样品表面进行聚焦。(b)在高折射率的透明样品内聚焦，球面像差使焦点模糊。
通过使用孔径实现共焦成像，可以弥补部分空间分辨率的损失，因为这将收集的信号限制在焦点周围的区域。然而，这伴随着拉曼强度的降低。减少意味着全部拉曼显微术的三维成像潜力没有用传统的显微镜目标解锁。
可以纠正使用数学校正的这种保真度。然而，这些在解决像差时的复杂性和完整性变化。还不可能恢复拉曼强度和空间分辨率的损失。可以在其他地方找到关于这些数学和半经验校正的更多深入信息，在本文中不会进一步讨论。1，2
或者，可以使用浸入物体光学地解决像差。通过填充物镜和样品之间的间隙，可以减少或消除球形像差，用折射率匹配流体（而不是空气）。简而言之，这恢复了丢失的空间分辨率和拉曼强度，并在样品表面中去除光的弯曲。
具有折射率的油N≈1.5（类似于许多聚合物材料的值）通常由漏油物镜使用。欧洲杯足球竞彩使用油的使用也促进了较高的数值孔径（更好的有效聚焦和分辨率），这增加了收集的拉曼强度。另外，通过浸没的油浸，样品形状的冲击减少，最终产生了优异的3-D拉曼成像结果。
本文举例说明了使用Thermo Scientific™DXR3xi拉曼成像显微镜的油浸物镜，以改善埋藏或地下结构的三维拉曼成像。
实验
一种Thermo Scientific™DXR3xi拉曼成像显微镜伴随的Thermo Scientific™amnic™Xi软件用于创建此处呈现的3D拉曼图像。OMNICXI软件中包含了使用交互式3-D可视化功能的三维拉曼数据集和用于生成3-D拉曼图像的三维拉曼数据集的两个工具。
奥林巴斯™MPlanN 100X BD物镜用于收集成像数据，作为代表性的冶金物镜，奥林巴斯™PlanApo 100X用于油浸物镜成像数据。所使用的浸渍油是无荧光的，折射率为1.516。对于所有的拉曼图像，在样品处使用功率为10 mW的532 nm激光。
结果与讨论
多层聚合物复合材料的研究是拉曼共焦深度分析的常见应用。
在本例中，所选的层状聚合物复合材料厚度约为124 μm，由5个不同的层组成。采用冶金物镜和浸没物镜，分析了体积为30 μm × 30 μm × 135 μm的图像，x、y和z方向的像素尺寸分别为1 μm和1 μm。在三个关键方面，浸没物镜的性能得到了增强:精确的层厚测量、提高信噪比和提高光谱纯度。
基于MCR（乘法曲线分辨率）和使用冶金物镜（A）和储油物镜（B）获得的3-D拉曼图像如图2所示。可以通过OMNICXI使用MCR分析自动分段层在分析之前，不需要任何直接了解组件的拉曼光谱特征。
图2。(a)利用冶金物镜对分层聚合物复合膜进行MCR分析的三维拉曼图像。(b)利用油浸物镜对同一层状聚合物复合膜进行MCR分析的三维拉曼图像。用油物镜分析，比用冶金物镜分析，层数更清楚、更清晰。
为便于对比，同一聚合物复合材料物理截面的二维成像结果如图3所示。当使用冶金物镜时，与使用油浸物镜的三维图像和从截面上获取的二维图像相比，层有显著的压缩。
图3。层状聚合物复合材料截面的二维拉曼图像和视觉图像。该参考测量显示的层厚度与使用油浸物镜的三维拉曼图像非常吻合。
从与横截面的储油物镜收集的3-D图像确定的层厚度与横截面的2-D图像决定的层厚度之间存在密切一致。使用冶金物镜的共聚焦3-D图像中的层也显然不明确并经历对焦的模糊和空间分辨率的损失。
清晰度的缺乏导致界面上光谱特征的混合增加。在厚度测定方面的一些额外的不确定性也是这个结果。通过使用浸没物镜可以获得测量层厚的优良结果。
拉曼强度的大幅增加是使用油浸物镜的另一个优点。图4显示了两组三维共焦成像数据对聚乙烯醇层中间位置的拉曼光谱的比较。绿色光谱代表油浸物镜，提供约3倍的拉曼强度和信噪比(S/N)的光谱。
图4。层状聚合物复合膜中聚乙烯醇层的光谱表明，拉曼强度和信噪比(S/N)至少增加了3倍。根据1441 cm处的峰值强度计算信噪比－1在2300 ~ 2200 cm范围内计算噪声均方根－1．
最后，通过用浸没物镜获取的3-D化学图像示出了各种聚合物层之间的更好的光谱分离。聚乙烯醇层在该样品中夹在两层聚酰胺之间，该样品在1635厘米处具有强大的拉曼带－1．通过比较这个光谱特征的相对强度和聚乙烯醇波段(1441厘米)的相对强度，可以测量光谱分离－1)．在图5中，蓝色的痕迹代表了从横截面图像中获得的合理纯聚乙烯醇光谱。
图5。层状聚合物复合膜中聚乙烯醇层的光谱来自于使用冶金物镜(红色)和油浸物镜(绿色)的3-D共焦数据集，以及物理横截面的2-D图像(蓝色)。峰值高度比(1635厘米－1/ 1441 cm-1)给出邻近聚酰胺层的光谱贡献的测量，并说明使用油浸物镜进行三维共焦拉曼成像时邻近层的光谱贡献减少了。
这基本上显示在1635厘米没有拉曼特征－1．图5中的红色痕迹代表了利用冶金物镜从三维体积中提取的聚乙烯醇的光谱。这突出了聚酰胺的一个小但明显的贡献，这将导致层之间的光谱混合。
然而，在用绿色痕迹表示的油浸物镜中，邻近聚酰胺层的相对贡献显著减少。这表明，在这种类型的三维共焦拉曼深度成像中，油浸物镜获得了较好的效果。
反过来，这导致了更精确的层厚度测量，提高了每一层的光谱纯度，并增加了测量的总体信噪比。不需要对样品进行额外的截面分析，因为结果与截面分析具有可比性。
折射率差异的影响会因非平面形状和表面而加剧。然而，在这种情况下，沉浸目标也可以应用。直径约为25微米的聚苯乙烯球(Polysciences, Inc.)的拉曼成像就是说明这一点的一个例子。欧洲杯线上买球用标准金相物镜和油浸物镜在玻璃显微镜载玻片上成像聚苯乙烯球。
图6显示结果。除了显着的拉曼强度损失之外，如图所示，如图所示，沿Z轴延伸和失真，具有用于球体的下半部分的冶金物镜。这是由于折射。在较小程度上，它也是由于由球体的弯曲表面和与周围空气相比的折射率差异引起的反射效果。
图6。（a）＆（b）使用冶金物镜收集的油浸没物镜，（c）和（c）＆（d）拉曼图像收集的25μm聚苯乙烯球体的拉曼图像。油浸没图像显示精确再现球体，而冶金物镜图像显示出显着的变形。
如图a和b所示，同一个球体在浸入物镜下成像时，显示出一个清晰的球体，没有细长的尾巴，边缘更清晰。这说明，在进行3-D拉曼成像时，由于样品的形状以及折射率的差异，可能会引入额外的复杂因素。然而，再次使用油浸物镜可以帮助减少这些影响。
这些原则也适用于具有不同层和非平面特征的样品，如双组分光纤。在双组分纤维中，有两个组分没有混合在一起，而是在纤维中有离散的排列(例如，并排、分节、芯鞘)。这些都是为了充分利用成分的不同性质而设计的。
在这里成像的双组分光纤中有一个芯鞘结构。该纤维的直径约为20微米，具有尼龙6的外护套和尼龙6,6的内芯。基于MCR分析的光纤三维共焦成像结果如图7所示。图像d, e和f是用冶金物镜拍摄的，图像a, b和c是用浸油物镜拍摄的。正如在聚苯乙烯球的例子中，当使用冶金物镜时，拉曼强度向纤维的底部显著下降，以至于纤维的底部根本没有定义。
图7。（a），（b），（c）使用油浸没物镜收集的双组分纤维（尼龙6,6（绿色）和尼龙6（紫色），芯鞘装置的共聚焦3-D拉曼MCR图像．（d），（e），（f）使用冶金物镜收集的相同双组分纤维的共焦3-D拉曼MCR图像。视图（c）和（f）显示沿着3-d拉曼MCR图像的Z轴分别为石油和冶金目标查找的切片。
在地核和鞘层的边界位置上也存在明显的不确定性。通过使用油浸物镜采集的相同纤维的三维图像显示出清晰、合理对称的截面。
当以与用分层聚合物复合材料采用类似的方式进行物理横截面时，它证明了该20微米纤维的尝试。纤维的物理变形是用于安装和横截面纤维的直接方法的结果。更严格的安装技术，例如树脂嵌入，将显着增加复杂性和所花费的时间。使用油浸物镜的3-D共聚焦拉曼成像提供了不需要复合样品制剂的无损溶液。
结论
利用共焦三维拉曼成像技术，可以在不暴露样品内部的情况下对半透明样品进行地下成像。冶金物镜可能擅长于表面分析，但当用于探测样品内部时，它们受到球差的影响。数学修正可以部分解释球差的影响，但不能完全补偿空间分辨率和拉曼强度的损失。
使用储油目标是光学解决这个问题的有效方法。它还可以增加多种材料的地下成像的性能，包括大多数聚合物。欧洲杯足球竞彩和DXR3拉曼显微镜在美国，油浸物镜是标准的附件，其直接实现有潜力在任何实验室解锁3-D拉曼成像的力量。
参考资料及进一步阅读
- J.拉曼光谱。2014年, 45岁,133 - 138
- M.P.Miguel，J.P. Tomba，J.Raman Spectrosc。2013年，44,447-452
这些信息来源于赛默费雪科学材料与结构分析公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩
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