欧米茄光学公司最近将其多光谱荧光检测系统改为流式细胞术。
该硬件最初是为共聚焦应用而生产的，由脉冲激光激励和一系列由光纤延迟线分隔的反射光纤尖端组成。
纤维阵列的近端尖端用作共聚焦针孔。随着串联中的每个光纤尖端将依次更长的波长反射到PMT检测器中，产生时间索引的频谱。最多10个光谱箱由反射光纤提示之间的波长间隔确定。
这种结构使得使用一个PMT在2.5微秒内获得多光谱数据集，可以进行光谱分离或更多处理。
一系列激发激光器光纤阵列和匹配的探测器可以放置在流动路径中，以进一步最大化潜在标签的数量。
基于光纤的方法可以同时识别细胞内的正向和侧向散射。据估计，在非成像应用程序中，每秒可组织多达8万个单元。利用欧米茄现有的硬件，每秒成像400个细胞是可以实现的。
用共振扫描镜代替目前使用的galvo镜可以进一步提高成像率。
通过对焦和散焦可以改变空间分辨率。本文将展示分选和成像通道的初步结果，以说明这种技术将如何产生具有多个通道的紧凑和轻量级流动系统。
图1。这种基于纤维的多光谱共聚焦显微镜是在NIH/NCI的SBIR资助下开发的。该独特的检测方案由2个连续阵列的涂层光纤针尖组成，在连续的时间点反射波长箱到检测器，在2.5 μs内构建每个像素的光谱。
图2。上图为单个光纤尖端的光谱响应。蓝色波长显示光纤损耗。整个光纤阵列的底层光谱响应。到达PMT的光是一系列以波长逐渐变长为中心的带通光。
图3。数据采集和显示过程
红色脉冲表示“GO”并被传送到激光器，该激光器向样本提供100ns激光脉冲。波长箱在过程中顺序返回到探测器。原始数据的速度是探测器限制。
第一个箱子是拒绝“蓝腿”光从红腿。第二个是空的，而容器3到12代表上面概述的波长容器。为了使脉冲之间能够恢复，并确保探测器提供最佳响应，延迟线彼此间隔一段距离。
对提出的数据进行处理，以消除通道中间的微小串扰，并弥补顺序光纤阵列的非中心对称状态。
这些是从GUI中获得的直方图示例，描述了在488 nm处激发的几个量子点的发射光谱。对每个像素检索并处理每个容器。
数据可以以许多不同的方式可视化。实时双向光纤组合器可以同时显示三个通道（RGB及更高版本），光谱角映射，多通道数学，单色单个通道和单色（最大像素强度）。
初步结果
该系统是为成像目的而设计的，因此它目前的能力是起点。由于当时无法独立控制反射镜，单点扫描被用来确定系统的速度限制。
图4。示出了与来自示波器的红色和绿色像素对应的混合珠子和原始数据迹线。红色像素为4μm，直径为2μm的绿色珠子。这些通过将RGB颜色分配给X，Y，Z分别来实时着色。
图5。在移动舞台时叠加连续图像。图像用RGB显示。我们手动移动舞台，同时获取序列图像，以说明系统的速度。注意，在这些速度下，形状不会受到运动的干扰。
方法 - 单点测量
使用100mm ID方石英管或拉圆玻璃管来复制流式细胞仪检测室．
这些被环氧树脂注入注射器针头和显微镜上的载玻片，以保持稳定的调查期间。对注射器进行手动压缩，以触发管内珠子的流动。
管内的珠子是系统的主要焦点。在此之后，扫描镜以居中和禁用。采用直接示波器输出来避免软件的图像处理功能以确定系统的速度。
使用imageJ分析示波器输出（TIFF）的时间响应的FWHM，以测量系统中珠子的线性速度。
最初的研究采用了直径为6毫米的6色Spherotech球珠来进行匀速预测和信号。此外，还对2mm绿色、4mm红色和6mm Spherotech珠的混合物进行了实验。
图6。（顶部）在舞台上安装的单点测量的示意图，（插图）照片的照片。
图7。这些是6毫米的球形珠，其具有各种强度水平。6 mm珠子的理论限制为2.4米/ s，每粒子会产生一个脉冲。电子噪音不会出现在所有垃圾箱中，而是用作随机钉，允许过滤。图片来源:欧米茄光学公司
图8。1 μm绿色微珠2 μm红色微珠6 μm多色微珠。该系统可以很容易地根据尺寸和光谱组成确定珠的类型。
结论与未来方向
实验证明，a10通道，单点荧光流式细胞仪检测系统可以实现1米/秒的线性流速。
系统的速度可以根据粒度进行优化。可以对这种安排进行修改，以合并前面和侧面散射功能，如图9所示。
对于系统的微小修改，预测10彩色成像检测也将在每秒高达400个细胞（直径为6μm）的速率下可达到10彩色成像检测。为此，如图10所示，需要改变镜像控制软件。
每个透视图都需要更新用户界面以优化流程。在这个系统的不断发展中，欢迎合作。
图9。通过增加一个反射器和一个光纤组合器，可以在探测阵列上增加前向和侧向散射通道。
图10。在成像模式下，一个x-镜可以用于栅格穿越细胞，同时检测反向散射方向。
参考资料及进一步阅读
- 高速多光谱共聚焦生物医学成像"，J. Biomed。Opt. 19(3)， 036016 (Mar . 21, 2014).;http://dx.doi.org/10.1117/1.JBO.19.3.036016
- Carver, ge, Chanda, s.k.， Morrison, w.a.， Locknar, s.a.， and Johnson, R.L.荧光多光谱成像系统美国专利9,155,474(2015年10月13日)
致谢
Harika Vengaladasu在数据收集、分析和海报准备方面寻求帮助。共聚焦仪器的原型是由国家癌症研究所通过NIH资助开发的(SBIR Ph. II 5R44CA124036-03)。
由欧米茄光学公司的Sarah欧洲杯足球竞彩 Locknar, John Barton和Gary Carver原创的材料制作。
这些信息来源于欧米茄光学公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩
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