原位杂交(ISH)的应用已经从广义的、短期的同位素方法发展到长期的、高度专一的、多色荧光-ISH探针分析(FISH)。
滤光片技术、数据处理、光学、相机和显微镜通过软件的发展，使大多数研究人员能够负担得起FISH系统。
应用mFISH (multiplex-FISH)，随着数字成像显微镜技术的进步，极大地提高了对染色体和基因中多个核酸序列的分析以及非同位素鉴定的能力1.．
滤光片和荧光成像
在直立显微镜下，荧光照明器沿着上荧光路径(头顶照明)到达标本。
滤光片位于通道内，通道由激励滤波器、二色镜和发射体组成。这些工作可以显著增加成像标本的亮度和对比度，即使是在使用多种荧光颜料时。
图1显示了直立显微镜上荧光照明器的标准配置。
图1。
episcopic(反射照明)路径的主要组成部分包括光源(本例中为汞弧光灯)，一系列聚焦光线的透镜，并在光束沿滤光片方向移动时补偿光学偏差。
还包括膜片，以确保标本的平衡和有效的照明，和过滤器转塔，其中设有过滤器组。
示意图示意图显示了如何利用炮塔中的激励滤波器精确过滤来自光源的宽带激励光，以专门传输绿色组件。这又通过二色镜反射到标本上。
红色荧光发射通过物镜透射回来，再通过发射滤光片过滤，然后用眼睛或相机观察。
图2显示了过滤器立方体的分解图像。激励滤波器显示为黄色，发射滤波器详细显示为红色，以显示标准带通德克萨斯红滤波器集。
图2。
过滤器的描述
有几种描述带通滤波器的方法。最广泛的是中心波长(CWL)和全宽半最大值(FWHM)命名法。或者，它们是已知的标称截止波长和截止波长。
在前者中，图2中的激励器被描绘成一个580/20，或一个标称CWL为580 nm和FWHM为20 nm的滤波器。在传输值处取一半最大值，其中滤波器已达到最大值的50%(图3，左)。
图3。
在后一种方案中，滤波器的截止波长为590nm，截止波长为570nm，而CWL没有详细说明。
切断开关描述了沿出现波长轴从滤波器衰减到传输的切换。截止描述传输后开关回到衰减状态。每个值都确定了50%的总传播点。
截止和闭合值也用于说明两种类型的滤波器，即长通(或高通)滤波器(如图4所示)和短通(或低通)滤波器(如图5所示)。
图4。
图5。
长通滤光片用于反射和/或吸收特定光谱区域的光。它在接通值(在本例中为570 nm)处转换为透射，大于这个值的光沿较宽的波长范围传输。
简而言之，过滤器的情况正好相反;在给定距离上，波长大于截止值的光被这些波长较短的滤光片阻挡。
需要注意的是，这些反射和透射区域并不是无穷无尽的，而是受涂层化学品、光的物理特性和涂层设计的特点的限制。
在多色标记方案中，为了尽量减少非常密集的荧光的光谱渗漏，需要专门的窄带滤波器集。
FISH和mFISH的特殊过滤器
当成像多个荧光探针时，必须采取特殊步骤在显微镜转塔组织滤光片。一种方法是对标本中的每个探针使用单独的滤块。
这是一种有效的6色观察技术（在大多数直立式研究显微镜中，6是滤光片位置的平均数量），因为通过仔细设计滤光片，可以成功实现不同探针种类的光谱隔离。
这种安排也减少了探针漂白的机会，因为一次只能照亮一种荧光物质。
该方案的一个可能的缺点是由于小的滤波器失调而导致图像配准的偏移。光束的轻微偏差是这种偏移的影响，但可以观察到切换几个不同的滤光片立方体。
二向色镜和发射滤光片是滤光片立方体的成像元件，是产生这种效果的两个元件。
另一种方法是利用不同的多波段二色镜和发射滤波器，并在外部滑块或滤波器轮中拒绝激励滤波器。
拒接将减少机械振动，维持图像配准，但由于彩色CCD相机的需求，动态范围和灵敏度降低，可分离的不同探头数量的限制，以及荧光灯亮度降低。
标准滤块通常配有荧光显微镜，用于广泛使用的德克萨斯红、FITC、TRITC和DAPI染色荧光。标准滤光片通常使用宽带发射和激励滤光片(有时使用长通发射滤光片)，以产生较强的亮度。
当应用FISH时，这些常规集可以成功地用于2、3和4色标记，但光谱穿透很容易成为一个问题。例如，FITC可以通过Cy3滤波器适度可视化，Cy3.5可以通过Cy5滤波器查看2.．
图6显示了五个单独标记的染色体对；顶部、中间和左下方图像中的箭头表示通道中间的串扰。序列的伪彩色叠加图像显示在右下面板中。
图6。
需要专门的窄带滤光片，以防止多色标记序列中荧光的光谱渗漏，因为这些序列几乎没有空间来分离成分。
10至20 nm的激励器滤波器和20至40 nm的发射滤波器提供所需的特异性，以达到所需的灵敏度和光谱分辨率姆菲什．
图7显示了覆盖在FITC和Cy3发射和激发峰上的常规宽带FITC滤波器组。
图7。图片来源:欧米茄光学公司
虽然过滤器被安排覆盖了吸收和发射曲线下相当大的区域，但与Cy3的激发和发射曲线存在很强的重叠，导致FITC通道被Cy3污染。
图8给出了一个解决方案。对激发和发射波段进行了限制，以提高Cy3的FITC光谱分辨率，特别是在发射波段。通过限制发射滤光片的红色边缘，Cy3染料发射曲线下的区域大约减少了4倍。
图8。
在设计系统中加入了窄波段、陡边滤波器，拓宽了光谱窗口，包括多个荧光探针，而无需在荧光之间应用发射流。
该系统如图9所示，详细说明了在低于300 nm的光谱窗口内有效分离的三种氟化物。第四种染料，如Cy 3.5，可在570至620nm区域加入该工艺，但此处不包括以减少堵塞。
由于对用于mFISH的过滤器的要求，有必要提供一系列特定的产品，这些产品协同工作，以最佳利用每个mFISH fluor的可用带宽。
图9。
表1显示了在mFISH中使用最频繁的荧光的Omega光学滤波器组的范围，并提供了激励和发射滤波器带宽。
除XF231和232外，每台都是单氟装置，XF231和232为每台氟装置和三波段二向色性和发射滤波器使用单激励器。
该系统通过一个单一的要求减少了登记移位和舞台移动。这是指当多波段二向色性和发射滤光片保持在显微镜转台的安全位置时，应重新定位外部滤光片轮或滑块以激发不同的染料。
表1。
| 集名称 |
荧光团 |
过滤器 |
| XF06 |
达皮，阿姆卡 |
励磁机:365/50 |
二向色性：400DCLP |
发射器:450/65 |
| XF201 |
DEAC |
励磁机:436/8 |
二向色:455 drlp |
发射器:480/30 |
| XF202 |
FITC, Cy2 |
励磁机:485/20 |
二向色性：505DRLP |
发射器：530/30 |
| XF203 |
Alexa 532 |
励磁机:520/18 |
二向色:545 drlp |
发射器：565/20 |
| XF204 |
Cy3，TRITC，Alexa 546 |
励磁机:546/10 |
二向色:555 drlp |
发射器:580/30 |
| XF206 |
Cy3.5 |
励磁机:572/15 |
二向色:590 drlp |
发射器:620/35 |
| XF207 |
德克萨斯红、
Alexa 594 |
励磁机：580/20 |
二向色:600 drlp |
发射器:630/30 |
| XF208 |
Cy5，Alexa 647 |
励磁机:640/20 |
二向色性：650DRLP |
发射器:682/22 |
| XF210 |
Cy5.5 |
励磁机：665/32 |
二向色:692 drlp |
发射器:710/40 |
| XF231 |
DAPI / FITC / TRITC |
每一种染料的单个激励器可安装在外部滤轮内，三带二色和发射器可安装在滤座内 |
| XF232 |
DAPI FITC / |
每一种染料的德州红单激励器可以安装在外部滤轮中，三带二色和发射器安装在滤座中 |
滤光片、染料、成像硬件和软件的适当组合是获得精确图像捕捉和分析所需的分辨率和对比度的必要条件。
以及使用专门的过滤器集mFISH技术，进一步优化图像质量的滤光片的特点是宽频AR(抗反射)抛光涂层和基片。
AR涂层可以通过减少玻璃界面处的二次表面反射来增加透射。此增强可使过滤器吞吐量增加7%3.．
在发射滤光片和二色镜上的AR涂层也可以减轻在有多个反射表面的光学路径中可能看到的“鬼像”。
抛光衬底是在发射和二向色滤光片上经常观察到的特征。当玻璃衬底暴露时，在其上通过双面抛光工艺产生滤镜，衬底达到高度均匀的厚度，称为“平行度”。
该方法具有减少传输图像中的强光束偏差的效果，当在滤波器组之间快速切换时，该方法提供了微不足道的配准偏移。
结论
FISH和mFISH技术与荧光显微镜的分辨率和自动数字成像能力相结合，提供了成功的优势组合。
从初级研究到细胞遗传学、癌症研究、产前疾病鉴定和病理学，它的好处将对生物学的一系列领域产生兴趣。
在荧光显微镜中，仔细选择样品和系统组件对于识别探针检测的最有利过滤器至关重要。
在固定转台上使用多波段二向色性和发射滤光片，在外部滤光片滑块或转轮上使用单激励器，几乎可以同时识别探头，而不会偏移对准。
很可能需要在降低的分辨率、色彩平衡难度和彩色CCD相机的总亮度方面做出一些妥协。
如果有限的光漂白、灵敏度和光谱分辨率是首要考虑的问题，理想的选择是单一窄带滤光片集，由黑白CCD相机检测。
在现代滤波器中，图像配准中的偏移通过使用抛光基片来减少。当使用构造为“零移”规格的滤波器集时，它们几乎被删除了。
过滤器的增强还受荧光探针的类型和数量的影响。通过适当的光谱分离，对有限数量的探头使用传统的宽带通滤波器是可能的。
建议在协议中使用5或6个探针时使用染料专用的窄带滤波器集，以减少光谱穿透
随着荧光显微镜FISH和mFISH方法的发展，必须使用软件和硬件来解码标本中的数据。
使用过滤器、染料、成像硬件和软件的有效组合来实现必要的分辨率和对比度，以获得和测量准确的图像是至关重要的。
故障排除
如果没有可用的图像:
- 确保荧光光源处于开启状态，并检查光路清晰度。当样品被光照亮时，通常可以被注意到，除非它低于400 nm (DAPI激发)。
- 确认图像被传送到适当的目镜、端口或相机。
- 检查正确的滤块在目标氟的位置。
- 如果所需的荧光发射波长超过大约670 nm (Cy5)，那么大多数人眼都看不到。如果它不能被相机看到，请确保相机没有包含红外阻挡过滤器。
如果在图中看到各种氟的高渗:
- 确认滤光片组设计用于单染料使用，且未使用宽带通滤光片或长通发射滤光片组。
术语表
- Anti-reflection涂层:一种光学薄膜干涉涂层，用于减少光从一个通道进入另一个通道时产生的反射。
- 分色镜：根据波长选择性地发射和/或反射光线。长通二向色传输宽光谱范围，同时有效反射短波长通过不同的光学通道。
参考资料及进一步阅读
- 陈志强，陈志强，陈志强，等。荧光原位杂交:研究实验室的硬件和软件意义。2008年10月7日取回
- Henegariu, o . 2001。多色的鱼。2008年10月8日取回
- 约翰逊,2006 b。Anti-Reflection涂料。欧米茄光学应用说明。
致谢
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