利用光镜和电子显微镜研究生物样本

在这次采访中，我们采访了Monash大学的副教授Alex de Marco，关于光镜和电子显微镜在生物样本研究中的相关应用，以及在他的实验室中多离子等离子体聚焦离子束(plasma FIB)技术的使用。

告诉我们一点你的背景与电子显微镜和其他显微镜技术。

我是在欧洲分子生物学实验室(EMBL)读博士期间接触到电子显微镜的。这是在所谓的“低温电子显微镜分辨率革命”之前，所以我们仍在开发低温电子显微镜的亚层析平均和结构生物学方法。

当我完成我的博士学位，我离开学术界一段时间，开始为FEI工作，现在是赛默飞世尔科学的一部分。我在那里工作了大约4年，最初是在研发部门，然后是产品管理部门，负责与体积成像和相关显微镜有关的所有工作。

这就是我开始同时研究电子显微镜和光学显微镜的地方，也是我第一次对原位结构生物学产生兴趣的地方，这也是我实验室的主要研究重点之一。

你能告诉我们更多关于你们小组的工作吗?

基本上，我们所做的是方法开发，以及一些硬件开发。我们试图促进成像，具有简化原位结构生物学过程的最终目标。

我在博士结束时帮助做的一件事。简化了电子显微镜的一些过程。当时，EM非常困难，因为所有目前的自动化仍然无法到位。对于所有意图和目的而言，这是一个领域。我发现有趣的是，一旦你有助于一个字段中的操作，就成为一个工具。然后可以使用该工具完成研究。

因此，我们想要做的是促进各种相关显微镜技术的应用，因此您不需要有10年的经验来执行这些类型的实验。

我们的第二个平行焦点是微加工。特别是，我们正在研究新的光学元件，特别是在微光学领域，具有从成像到光刻的潜在应用。然而，目前，我们主要关注物理光学方面，而不是这些应用。

你们的小组最近有所发展光子离子电子显微镜(派镜)，集成的Cryo-FiB和光学显微镜。你能告诉我们这个乐器的发展是什么吗？

在执行Cryo相关显微镜时总有两个主要问题。首先，您的光学显微镜是多么好，无论您尝试如何在仪器之间简化转移，都不重要，总会有一些污染和样品损失。

第二个问题是时间。如果你仔细想想，任何实验室最大的开支都是薪水。当你有一个高技能的人，他们只是花时间浏览样本，在屏幕前等待，你并没有真正最好地利用你的资源。

因此，对两个问题的解决方案是具有尽可能自动化的过程。为此，您需要确保工作流的不同组件可以彼此交谈。对我们来说，最简单的方法是整合一切。它真的很好地工作，因为我们能够提出一个解决方案，我们没有任何妥协。

使用PIE-scope，我们可以在不使用浸没的情况下实现最高分辨率的成像。因此，质量相当于任何独立的低温光学显微镜，没有任何影响FIB或扫描电镜(SEM)的性能。实际上，我们最终做出了一些真正简化人们生活的东西。

你能用于之前不可能的饼图做什么？

我们可以在样品准备好之前，立即筛选多个栅格。以前，你只能使用完美的样本，但是现在，如果你的一个样本有很少的理想区域，或者另一个有更多的理想区域，就不再重要了。一旦样品进入，你只需用FIB来准备薄片，即使你只有一个好的点。筛选可以自动进行，因为一切都在一个封闭的环境中，这个环境是机动的，完全由电脑控制。

基本上，这个仪器节省了时间。它也比购买单独的显微镜便宜，外壳/底座和专用电子设备的所有成本都被节省，而且你不需要任何专用的实验室空间。

网格的准备工作对于从事低温电子显微镜研究的科学家来说仍然是一个障碍，所以我可以想象如何消除人们的一些挫折可以带来巨大的好处。

是的，还有其他优势。例如，当你改变模式时，相关显微镜的一些问题就出现了，因为你永远不知道不同仪器之间的扭曲会是什么。在PIE-scope的情况下，一切都是固定的，一旦你校准了，你真的不需要做任何事情。你只要把两个图像对齐。

您是第一批真正探索等离子体FIB用于生命科学应用的科学家之一。欧洲杯线上买球当您第一次开始时，您所面临的一些挑战是什么?血浆FIB是如何被整合到您的实验室工作中的?

我真的开始在FEI探索等离子体FIB的应用。当时，我对加快样品制备很感兴趣，因为作为一名研究员，你想要分析数据。你不会想坐在那里，看着显微镜做某件事15分钟，然后重新开始，如此反复，因为那样会耗尽你的一天。我认为等离子体FIB的使用可能是一个潜在的前进路线，而且非常棒的研发团队，向我们展示了一个多离子源[现在是Helios Hydra DualBeam]。

Helios Hydra DualBeam

这很有趣，因为氙气，等离子体FIB的典型离子种类，对半导体进行了优化，所以对于一些样品来说，它的性能并不好，而且很难使用。在这种情况下，只要按下按钮，就能有机会接触到其他三种离子(氧、氮和氩)。就像有四个不同的显微镜在一个。所以，我们开始探索不同的离子源对生物样本的作用。

然而，事实证明，这是一个比我们最初想象的更大的机会。使用等离子体FIB，样品制备可以很快完成，束损伤可以很好地控制。所以，制造相对大的图案是非常快的。从那时起，我们开始研究微光学，这不是我实验室的重点，直到我有Helios Hydra.．

我们现在所做的是模拟数千个不同的镜头。我们可以在10分钟或更少的时间内做出来，然后测试看看它们是否好。这完全改变了我们进行研究的方式，因为在物理光学领域，在过去的15到20年间，有很多文章和理论研究。欧洲杯猜球平台一切都是理论上的，因为没有简单的方法来制造镜片。

现在，我们只是制造它们并检查理论工作是否实际上是正确的。在未来，这将带来大量的优点，束塑料和非常复杂的光束的构造。

在生物学方面，这台机器的主要用途之一是批量采集，也就是所谓的FIB-SEM断层扫描。这个想法是你用撒谎来擦亮你的脸，然后你想象它。然后你再打磨一次，你重复这个过程很多次你需要产生一个被研究样本的三维重建。在这里，我们发现氧等离子体束产生了非常好的结果，因为它形成一个非常平坦的表面(比镓FIB快2倍)，而且人工影响最小。

值得注意的是，虽然成像速度是它的两倍，但你可以线性缩放的面积，它没有指数缩放。因此，我们现在可以在合理的时间内制备出8-10倍大的面积[相比于镓FIB]。当然，这导致了一个新问题，因为最初的目标是加快数据收集，而我们所做的只是收集更多的数据。所以，我们真的没有实现我们的目标，但我想这是人类的天性。

但一般来说，发生了什么，正是我们现在能够检查组织的整个区域，并了解事件在更大的环境中发生的事件。对我们来说，这真的是革命性的。当我们做好薄片时，与常规镓FIB相比，我们发现它比较少30％。而薄片可以极薄，所以薄片质量也似乎更高。

我们还生产更优质的TEM显微照片;我们不太了解为什么这发生，但了解这个过程非常有用。然而，尽管如此，再次，时间，以及我们可以碾磨和准备非常大的样品的事实。

例如，许多实验室最近开始做低温提出样品制备，即直接从样品制备薄片，而不是从单个孤立的细胞。要做到这一点，你必须清除周围的组织你想要提出来的区域，这需要非常大的沟。使用等离子体FIB，我们可以在几分钟内完成，而镓则很容易需要几个小时。

这一切都是通过氧气PFIB完成的吗?或者你是用一种离子粗磨，然后用另一种离子抛光，等等?

通常，粗磨是在氧气中进行的，因为它似乎是最有效的清除大块。除了溅射外，很可能还发生了一些化学效应，因为我们看到碳基材料的再沉积率很低。

然而，我们确实发现，氧气抛光不是很理想，造成的损伤比我们想要的更多。在这里，我们开始用氩气和氙，因为我们可以很容易地转换。目前，我们仍在尝试理解使用其中一种进行润色的好处。

总的来说，你认为FIB在生命科学和低温电子显微镜领域的未来是什么?欧洲杯线上买球

就我个人而言，我希望这个领域不再是一个领域，而是一个工具。也许这不是每个人的期望，但我希望它与我们目前看待荧光显微镜的方式相似。用低温电子显微镜成像你的样本的行为不应该是你的研究的主要焦点;它应该只是提供数据的工具。因此，理想情况下，一切都应该流线型，即使是在原位亚细胞生物学。

例如，在单粒子分析（SPA）中，事情变得越来越自动化。对于一些更简单的蛋白质和复合体，几乎没有需要手动互动，从您设置数据收集到实际上具有结构时需要的那一刻。这对每种蛋白质不起作用，但它适用于足够的情况，更多的实验室实际上是进入水疗中心，特别是那些重点在于事物的生物学或药理学方面与纯粹结构生物学的案例。对于他们来说，这已经是更多的工具。它为他们提供了他们想要的信息，然后他们走开，他们执行其他一些实验。理想情况下，这也是我希望在原位结构生物学中看到更多的东西。

然而，要做到这一点并不那么简单。根据FIB和TEM自动化技术的最新进展，我们每小时可以观察4-5片薄片，得到4-5张相应的断层扫描图。数据虽然存在，但随后我们就遇到了严重的瓶颈。
当您查看截面显像时，您可以识别核糖体，囊泡，均匀膜和主要细胞器。但实际上，几乎每个人都会在某些时候提出的问题是，“那是什么样的？”因为在许多情况下，你面前的东西基本上是一个你无法识别的斑点。你只能猜到它可能的东西。

我们需要找到一种有意义且有效的方式来给这些断层扫描图和数据贴上标签。在这方面已经做了一些努力，例如，模板匹配，它可以非常有效。但总的来说，我们仍然会问，“这一团是什么?”“当我们观察细胞内的电子密度时。可靠地回答这个问题可能是下一个重大挑战。

这变成了一个解释的问题，而不仅仅是图像质量的问题。

这是对的，所有答案都不会来自电子断层扫描。您需要一个使用晶体学或其他方法获取的先验信息，以实际上了解您在断层图像中所看到的内容。

因此，将结构生物学作为工具的道路似乎相当漫长，但这是令人兴奋的时代，因为我们不再受计算能力的限制，越来越多的数据变得可用。每年被发现的蛋白质结构的数量都在不断增加，我们可能很快就会有足够的结构来用它们来解释断层扫描图。

关于Alex de Marco

我在约翰·布里格斯博士的团队中获得了EMBL博士学位。在这里，我为高分辨率低温电子层析成像和亚层析成像平均的图像处理的发展做出了贡献。博士毕业后，我去了FEI公司(现在的赛默飞世尔科学公司)，在那里我曾担任FIB/SEM显微镜和相关显微镜的产品经理。2015年底，我在莫纳什大学建立了自己的实验室。在这里，我的研究集中在聚焦离子束显微镜，电子显微镜和相关的FIB/SEM显微镜的方法和硬件开发。