srrf流+超分辨率显微镜的方法

受物理法律的限制，科学发现和知识的进步可以在一系列缓慢的程序中束缚。在显微镜下，直到21岁^英石世纪，光的衍射极限是一个看似难以穿透的障碍。据信，符合物理规律，如果它们之间的距离小于用于观察它们的光波长的距离，则两点不能解决（分离）。

有效地，这决定了实践中，光学显微镜可以仅解决具有200nm或更大的分离距离的物体/结构。因此，由于许多亚细胞结构和细胞器小于200nm，因此200nm的屏障将显示相当多的知识间隙等待被揭露。

21世纪的头十年^英石世纪，科学家和研究人员使用一系列创新的显微镜技术成功地解决了光线衍射极限所呈现的障碍：新发现领域正在出现。与衍射极限的成像随着用于超分辨率的新方法的开发并行地发展。

超分辨率显微镜包括的方法;风暴/棕榈（随机光学重建显微镜）/（荧光光活化定位显微镜）;STED（刺激​​排放耗尽显微镜）;和SIM（结构化照明显微镜）是研究人员易于获得的技术。

虽然超分辨率的方法已经开放了一个新的发现领域，但介绍了对这些方法的一些限制。采集的高能量要求，复杂的样品准备程序和长时间的收购时间，在尝试Live Cell成像时使该系统不适合（如果不兼容）。

此外，光学标准和计算机功率要求产生成本高得令人望而却步，这使得许多实验室无法使用SR方法。

最近，旋转圆盘共聚焦技术的进展已经证明适合于活细胞成像，实现了超出衍射极限1.6倍的改进。这是通过光学过采样和计算重分配的组合实现的，然而，这是以大大减少的视场为代价的，从降低的本地分辨率开始。此外，它仍然不可避免地受到昂贵硬件成本增加的影响。

由于其创新的自定义针孔间距分离和针孔尺寸，蜻蜓旋转盘共聚焦具有改善的天然轴向和横向分辨率，该组合具有用于常规成像的改进分辨率的组合。此外，利用所获得的图像上的光子重新分配（DeconVolution），蜻蜓的最终轴向和横向分辨率可以是240nm和139nm。

然而，如果研究人员需要改进的解决方案，问题仍然存在问题？或者，无法访问旋转盘共聚焦显微镜？是否存在与实时成像兼容的替代方法，可以在整个视野中快速获得超级分辨图像，并且如有必要，在细胞内部深度？在使用SRRF或SRRF-Stream +时，这些问题的答案是绝对的（图1）。

图1。对比共焦成像、共焦成像与反褶积、共焦成像与SRRF-stream+。高放大倍数的特写镜头是为了更好地显示所获得的分辨率。双酚a细胞用phalloidin、moto tracker和DAP图像用Ixon 888共聚焦模式(无SRRF)和SRRF-stream+共聚焦模式。

2016年，Henriques实验室使用称为SRRF - 超分辨率径向波动（1）的技术开发了一种非常规方法。SRRF可以与宽ffield，TIRF或Concocal结合使用，并且决定性的解决方案将依赖于收购数据集的礼物。

利用SRRF算法，研究人员可以在XY中获得高达50 nm(1)的分辨率。此外，SRRF算法不需要非常规或复杂的样品制备或特殊的荧光团来购买，使其与标准荧光团和荧光蛋白兼容。

首先，一个超分辨率SRRF图像可以通过平均捕获20-100帧(更多帧导致更高的分辨率)获得，这种成像所需的能量大约是每厘米mW到W²范围。这些属性根据实时电池成像使SRRF兼容（1,2）。最初，SRRF被提供为imagej插件，并获取SRRF图像，有必要进行长收购工作流程。因此，通过在图像j插件 - nanoj中获取数据的获取后处理来最终获得SRRF图像。

图2。SRRF和SRRF流分辨率随着每个时间点获取(和处理)的帧数的增加而增加。A)分辨率随获取帧数的增加而增加的图。可以观察到，直到100帧的增加高。意味着分析的所有径向波动相关的平均值（在不同的兴趣区域 - ROI）。最小值显示给定ROI的最大分辨率。B1和B2)在Andor Dragonfly上使用TIRF (B1)拍摄的肌动蛋白丝，以及使用飞行中的srrf流处理(B2)拍摄的TIRF。即使在获取TIRF模型中也可以观察到，SRRF流提供显着增加的分辨率。

2018年期间，Ador和Henriques教授之间的合作，Andor推出了SRRF-Stream，这是其在SRRF算法的应用，该算法实时使用单击按钮实时生成超分辨率图像。与初始SRFF算法一样，SRRF流的分辨率随着每个给定时间点拍摄的每个越来越多的帧而变得更好。这最突出至100帧，从100帧到500帧实现更稳定的增加，以及从500帧开始（图2,3）的分辨率的完全改善。值得注意的是，其他因素会影响奈奎斯特采样，放射性放大，曝光时间和环半径增加的分辨率;应该测试这些以实现最佳结果。

图3。srrf流的分辨率随着每个时间点获取的帧数的增加而增加。100nm的四层微珠成像，并测量FWM。我们可以观察到，通过100个SRRF帧获得，所以TERTASPECK珠子的FMW是50 nm．使用srrf流算法可以精确测量100 nm的珠片，并获得100帧。在共焦模式下获取图像，在共焦模式下不同srrf流每点获取的图像图像分别为:100、200、500、700、1000。感谢爱丁堡大学遗传与分子医学MRC研究所高级影像资源主任Ann Wheeler博士。

Andor的SRRF-Stream是一种显着的改进，使活细胞超分辨率，深度内部细胞和组织超过盖玻片顶部。

SRRF-Stream由iXon-EMCCD相机独家提供，通过微管理器和控制Dragonfly共焦的Fusion软件。SRRF-Stream的好处如下(3,4):

• Disrupts the diffraction limit of light by providing Super-Resolved images with 2 to 6-fold increase in the final resolution (50-150 nm), depending on which imaging mode is being utilized (i.e. confocal, widefield, or TIRF) as well as the experimental conditions
• 通过改进工作流和防止后处理的需要，实现实时超分辨率图像。
• 使用低励磁功率强度进行成像（MW至W / cm²）。这导致与延长的活细胞观察和细胞生理学的最小影响相容性更高。
• 与典型的荧光团和荧光蛋白兼容
• 简单的样品制备

因此，SRRF-Stream是任何显微镜的经济溶液，因为所有这些都可以转化为超分辨率显微镜。SRRF-Stream与任何成像技术兼容，特别是共聚焦，宽野地，TIRF和（图4）。2020年7月，发布了对SRRF流算法的进一步改进：SRRF-Stream +，（图1,4,5,6,7）。

图4。比较不同的成像模式(宽视野和共聚焦)，带有和不带有SRRF-Stream+ Hela细胞染色的MLKP1(红色)，a-微管蛋白(绿色微管)和DAPI(蓝色dna)在蜻蜓上用Ixon888相机进行成像。

在增强的径向测量中SRRF-Stream +超出以前版本的SRRF的步骤。最初，在6个方向上计算辐射性测量，而现在它们在24方向上计算（图5）。此进步将优化您的超级解析处理数据的结果以及删除先前在诸如Kinetochores（图7）之类的圆形结构中明确可见的周期性星形伪影。

图5。SRRF流和SRRF流+中的辐射计算测量值可以通过图像观察，增加的计算辐射性测量将提供更准确的SRRF图像结果。

返回最佳结果SRRF-Stream +，用户仍需要根据奈奎斯特标准获取图像。如前所述，当过采样系数为2.3或更高时，将获得分辨率方面的主要优势。然而，当过采样系数为1.5时，使用SRRF-Stream+仍然可以产生令人满意的结果。¹

图6。SRRF-Stream+提供高质量的超分辨率图像。用phalloidin(红色)、mitotracker(绿色)和DAPI(蓝色)染色的双酚a细胞，用Ixon 888 Ultra共聚焦模式(无SRRF)和SRRF-stream+共聚焦模式成像。

在分析图1,4,5和7中可见的插图时，SRRF流+的优点是清晰的，但许多潜在用户可能仍可能存在一些重要问题：采集速度如何影响？如果srrf-stream +在24方向而不是6的情况下计算放射性而不是6个

图7。SRRF流+提供高质量的数据。在非常高的放大率下，在特定的结构中，这样的结构有活动丝，某些恒星伪影偶尔会出现。SRRF-Stream+ 24个方向的辐射度计算消除了恒星伪影。用IXON888超相机在蜻蜓上成像为CENP-A（绿色KINETOCHOROOCHORO）和DAPI（蓝色DNA）染色的HELA细胞。

在开发最新的SRRF算法时，Andor认为采集速度也是许多研究者的一个重要参数。它已经有可能获得增强的图像质量与名义上的影响，采集速度。为了实现这一点，CUDA的性能已经完全最大化，利用nVidia显卡的巨大计算能力来加速SRRF-Stream+计算。因此，100个时间点，每个时间点50张srrf流+图像(相当于500张图像)的延时采集与原始srrf流只相差0.5秒。²

关于Andor原始SRRF流的好处，它们在SRRF流+中保留，但具有增强的图像质量。超分辨率成像处理仍然以快速处理速率完成，比imagej srrf快30倍（“NanoJ-SRRF”)。此外，SRRF图像采集/处理是实时捕获的，与数据的获取并行:算法生成的图像最终分辨率在50-150 nm之间。

此外，由于能量要求低，SRRF流+是活细胞显微镜的完美解决方案。通过利用大型视野和粗略地，可以获得超分辨率的图像，并且超分辨率显微镜不限于细胞表面事件。通过SRRF-Stream +，可以想到，在细胞或组织内部深度解析的图像，而不需要复杂的样品制备。

随后，自推出以来SRRF流，它已广泛用于各种应用。在IXON摄像机（4）中使用的SRRF流的实例包括：观察Mitochondria通过微管稳定化（5），或在间充质干细胞中检测HIF1α核易位的检查。（6）蜻蜓多式联社组织系统是还用于产生SRRF流图像，实例包括使用致敏工具（7）研究细胞因子，除了研究II类PI3KS在克拉仑依赖性吞噬作用中的影响。（8）

SRRF-Stream +的其他应用涉及调查蛋白质结构在子细胞器水平，个体脉冲蛋白机械的膜融合研究，跟踪细胞内的单分子，细胞内骨骼重组（肌蛋白纤维网状的改变）。

总之，SRRF流算法的进步提供了Live-Cell兼容超分辨率，结果显着改善。SRRF-Stream +产生不含伪像的内部结构的超分辨图像，补偿摄像机固定图案噪声的影响，又提供增强的高质量超声图像。

参考书目

1. Gustafsson，N.，Culley，S.，Ashdown，G。等．快速活细胞常规荧光团纳米镜，通过超分辨率径向波动进行ImageJ。NAT CANCE12471(2016)。https://doi.org/10.1038/ncomms12471
2. Culley S, Tosheva KL, Matos Pereira P, Henriques R. SRRF:万能活细胞超分辨率显微镜。国际生物化学杂志Cell Biol. 101:74-79(2018)。https://doi.org/10.1016/j.biocel.2018.05.014
3. Browne M. 12个原因为什么你的下一个共焦应该是蜻蜓。（2017）https://www.oxinst.com/assets/uploads/downloads/Dragonfly-Twelve-Reasons-Why.pdf
4. COATE C，'SRRF-Stream'：相机中的实时超分辨率。（2017）https://andor.oxinst.com/assets/uploads/documents/srrf-stream-technical-note.pdf.
5. Choi, ge, Oh, J.Y, Lee, H.J.等等。糖皮质激素介导的ER-Mitochondria接触者通过微管稳定化减少AMPA受体和线粒体贩运细胞末端。细胞死亡说1137(2018)。https://doi.org/10.1038/s41419-018-117219-018-1172-Y.
6. Lee，H.J.，Jung，Y.H.，哦，J.Y.等等。在缺氧适应过程中，BICD1介导间充质干细胞HIF1α核转位。细胞死亡有所不同26,1716-1734（2019年）。https://doi.org/10.1038/s41418-018-0241-1
7. 光遗传学控制沟形成的srrf流成像显示局部和协调的胞吞和胞吐介导膜重塑。ACS合成器。BIOL。9,4,902-919（2020）。https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00521
8. Aung，K.T.，Yoshioka，K.，Aki，S。等．II类磷酸阳性3-激酶PI3K-C2α和PI3K-C2β差异调节人血管内皮细胞中的克拉氏蛋白依赖性吞噬作用。杂志Sci69,263-280（2019）。https://doi.org/10.1007/s12576-018-0644-2．

参考资料及进一步阅读

1. 有关如何在IXON相机上采样的更多详细信息，请访问Andor OriginalSRRF流技术说明．
2. 使用Ixon Ultra获得1024 X1024的全视场图像。

此信息已采购，审查和调整Andor Technology Ltd.提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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